COMPENDIO eDE BACTERIOLOGIA BASADO EN LAS EXPLICACIONES DEL DR. ARISTIDES ^GRAMONTE. CA- TEDRATICO TITULAR 'b£ LA ASIGNA- TURA EN LA UNIVERSIDAD DE LA HABANA, Redactado por el DR. ARTURO CURBELO Y HERNANDEZ - AYUDANTE GRADUADO - Eq colaborador) coi) los alumr)os: J. R. GONZALEZ. L. N. HENR1QUEZ. J. P. MEDINA. TE&NO BACTERIOLOGO j TECNICA BACTERIOLOGICA LECCION I Medios de Cultivo. Se entiende por medio de cultivo toda sustancia líquida o sólida, natural o artificial, que dedicamos al desarrollo y pro- creación de las distintas especies de bacterias. REQUISITOS DE UN BUEN MEDIO DE CULTIVO: Todo buen medio de cultivo debe reunir los requisitos siguientes: l.° HUMEDAD, este es principalísimo. Aunque sabemos que existen los medios sólidos, estos no carecen de elementos lí- quidos y su solidez es relativa, pues sabemos que la forma ve- getativa de la bacteria sufre mucho con la desecación. | 25 ALIMENTOS SUFICIENTES, es decir, que debe grontener sustancias que la bacteria pueda utilizar para su nu- rtrición y de esta manera formar protoplasma y multiplicarse .rápidamente. 3.° REACCION APROPIADA, pues la gran mayoría de las especies bacterianas se desarrollan mejor en medios de reac- 5 Técnica Bacteriológica ción neutra o ligeramente alcalina, que en aquellos que tienen reacción ácida. Sin embargo, algunas se desarrollan muy bien en medios que tienen esta rea< ción, p adiendo entonces fijarse de una manera precisa el grado de reacción que es mejor para el desarrollo de cada especie. Este es un asunto muy importante; pero que debe ser objeto de estudios superiores. 4.° CLARIFICACION, esta es una operación que debe realizarse muchas veces, sobre todo en la manufactura del agar- agar, pues de esta manera puede observarse mejor el desarrollo de las colonias de bacterias. 5.° ESTERILIDAD, este requisito es de los que puede llamarse indispensable, pues sin él no podremos realizar tra- bajo alguno en Bacteriología y consiste en que los medios que utilicemos para nuestros estudios deben estar completamente li- bres de todo germen antes de ser utilizados para una siembra. DIVISION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivo se dividen, según su consistencia, en dos grandes gru- pos, que son: líquidos y sólidos. MEDIOS DE CULTIVO LIQUIDOS: Estos se dividen en naturales y artificiales. Un medio de cultivo, líquido natural, es aquel que se em- plca sin variación notable de como él es naturalmente, siempn que sea normal y aséptico, el lugar de donde proceda. Tenemo. entre estos, el suero sanguíneo, la leche, la orina, serosidade. naturales, ej. humor acuoso, agua de coco, agua de malta, etc Se emplean también líquidos patológicos del organismo siempre que no lleven germen alguno, como por ejemplo, líquido de hi- drocele, de ascitis, etc. 6 Compendio de Bacteriología Los medios de cultivo líquidos artificiales, son aquellos fa- bricados especialmente para satisfacer las necesidades de la Bac- teriología, entre estos el más universalmente empleado es el caldo simple o bouillon, aunque también son usados, las infusio- nes vegetales (agua de heno), soluciones de peptonas, solucio- nes de distintos carbohidratos, maceraciones de viandas, etc. MEDIOS DE CULTIVO SOLIDOS: Como los líquidos, también se dividen en naturales y artificiales. Los medios de cultivo sólidos naturales son aquellas sustan- cias sólidas que sirven para el cultivo de bacterias y que se en- cuentran en esta forma en la naturaleza, y los líquidos natura les que se pueden solidificar; entre los primeros tenemos, dis- tintas frutas, carbohidratos, (ñame, yuca, boniato), distintas raíces, trozos de carne, huevos y entre los segundos, el suero sanguíneo, fragmentos de órganos, etc. Los medios de cultivo sólidos artificiales son aquellos que tienen esta consistencia y que son fabricados por el hombre, en- tre éstos, los principales son: la gelatina, agar-agar, miga de pan, caldo con agar, gelatina con agar, gelatina con caldo, etc. El suero sanguíneo puede emplearse como tal o solidificado. La solidez de estos medios es relativa, y aunque reciben ge- neralmente el nombre de medios sólidos, son más bien medios blandos. De los medios líquidos que más se usan son los artificiales y entre ellos, los caldos. Será, pues, la preparación de éstos so- bre la que insistiremos, preparación que puede llamarse "stan- dard" para las demás variedades de medios líquidos artificia- les, siempre teniendo en cuenta las pequeñas variaciones de que cada uno es susceptible. 7 Técnica Bacteriológica CALDO SIMPLE O BOUILLON: Es un buen medio de cultivo bacteriano y uno de los más utilizados en la práctica. Con él se prepara el agar-agar y la gelatina. Existen muchas variedades de caldos; casi todos ellos se derivan de éste, por la adición de distintas sustancias, según que sea bueno para el desarrollo de la especie bacteriana que se estudie. De esta manera tendremos los caldos azucarados, los cuales se obtienen mediante la adición de 2 a 4% de glucosa, sacarosa, manita, etc.; los caldos glicerinados, al 5% de glice- rina sobre el caldo simple, y así los demás caldos, carbonatados, caldo-suero, caldo-sangre, etc. PREPARACION DEL CALDO SIMPLE: Su método de preparación depende de las condiciones económicas del Labora- torio en que sea hecho. Al comienzo, son dos las fases de su preparación. Para prepararlo, podemos emplear riñón, hígado, bazo, timo u otras visceras, sobre todo en cultivos de bacterias que tengan alguna afinidad por alguno de estos órganos. Pero el más empleado es el caldo de carne fresca muscular, que está esencialmente compuesto de macerado de carne some- tido a una infusión. También puede hacerse de extracto de car- ne que viene especialmente preparado y se encuentra en el co- mercie. El que se usa en nuestro Laboratorio es de la marea Liebig. En (1 primer caso se toma una libra de carne fresca, des- provista de tendones, aponeurosis, nervios, etc.; se corta en pe- queños fragmentos; se coloca en un recipiente apropiado que contenga 1,000 gramos de agua destilada y se macera en frío hasta doce horas o en caliente a 50 grados centígrados durante 8 Compendio de Bacteriológia media hora, prefiriéndose la maceración fría a la nevera para evitar su putrefacción. Este macerado se exprime entre una tela humedecida, para separar las fibras y recoger en un recipiente el líquido resul- tante, y se agrega agua destilada hasta completar de nuevo los 1,009 gramos. A esto se le añade 10 gramos de peptona, sustancia que tiende a evitar la esporulación, y además 5 gramos de cloruro de sodio. La peptona que nosotros usamos es la de Witte y en cuanto a la elección de ésta debemos preferir aquellas que no contengan sustancias antisépticas para su conservación. En el caso de usar un extracto de carne de los que se en- cuentran en el comercio, debemos hacerlo con tres gramos, en el caso de la de Liebig. Ya está preparado el caldo. En estas condiciones, si noso- tros colocamos en él un papel de tornasol, veremos que su reac- ción es fuertemente ácida, condición que en la práctica corrien- te es perjudicial al desarrollo bacteriano. Tenemos, pues, que nautralizarlo. NEUTRALIZACION DEL CALDO: Cuando se quiere proceder rápidamente a esta operación, basta tomar de la solu- ción normal de hidrato de sodio y agregársela al caldo (la solu- ción normal de hidrato de sodio, se hace en la proporción de 40 por mil de agua) y con dos papeles de tornasol, uno rojo y uno azul, se va tomando la reacción conforme se va agregando la solución alcalina. Cuando el papel azul, que al comienzo cam- biaba al rojo en contacto con el caldo, mantenga su color pro- pio y el rojo que no variaba de color empieza a tomar los pri- meros tonos azulados, la reacción habrá terminado. Demás está 9 Técnica Bacteriológica decir que este procedimiento es poco exacto y que induce a mu- chos errores. Algunos autores fijan la cantidad de solución nor- mal alcalina, para 1,000 ce. de caldo, entre ellos Parks & Wi- lliams, en 7 cc. para el litro. Fácilmente podemos darnos cuen- ta de que son muchos los factores que en cada caso particular influyen en la reacción del medio, y no todas las veces será exac- ta esta cantidad para una neutralización completa. Esto podría ser posible cuando el caldo es elaborado siempre en las mismas condiciones y por una misma persona, a pesar de que todas las veces que se disponga de bastante tiempo debe realizarse la ope- ración que describiremos subsiguientemente. PROCEDIMIENTO DE TITULACION QUIMICA.-Pa- ra hacer esto tomamos 4 o 5 tubos de ensayo, perfectamente la- vados y en cada uno de ellos echamos 10 cc. del caldo y un pa- pel rojo y otro azul de tornasol. Después, con la bureta, toma- mos de la solución decinormal alcalina (diez veces más débil que la solución normal) y vertemos medio centímetro cúbico en el primer tubo, uno en el segundo, y así aumentando de medio en medio centímetro cúbico. Entonces observamos el color de los papeles de tornasol o mejor, los vamos observando conforme vertemos la solución alcalina, y tomaremos como resultado aquel tubo en que el papel azul de tornasol, no cambie su color o me- jor dicho, lo recupere y en que el rojo comience a tomar el co- lor azul. Apuntaremos entonces la cantidad de solución utili- zada en ese tubo. Hallado esto lo demás consistirá en hacer una simple proporción aritmética en la cual ya tenemos los tres fac- tores principales. Suponiendo que en el segundo tubo sea en el que se halla producido la reacción deseada, diremos: si para neutralizar 10 cc. hemos necesitado 1% cc. de solución decinor- mal de sodio, para neutralizar 960, necesitaremos una cantidad 10 Compendio de Bacteriología X. Así tendremos: 10 : 1.50 :: 960 : X de donde: 1.50 X 960 X = -=144 10 Será, pues, 144 ce. la cantidad de solución decinormal de sodio, que necesitaremos para neutralizar los 960 ce. del caldo; pero como será una cantidad de líquido tan considerable que nos modificará bastante la composición del medio, lo que haremos es reemplazar la solución por su equivalente en solución normal, que, como es más poderosa en su poder de alcalinidad, tendre- mos que usar de ella mucho menor cantidad de líquido, así ten- dremos: que, dividiendo 144 por 10 nos dará, la cantidad de 14.4, que será la cantidad de solución normal alcalina que nece- sitaremos para neutralizar los 960 ce. del caldo, t CLARIFICACION: Ya tiene el medio una reacción apro- piada para la siembra de las bacterias; pero aparecerá algo tur- bio, lo cual sino es perjudicial para el desarrollo de las bacte- rias, se opone por lo menos a la observación macroscópica del cultivo, que nos permite conocer el estado de germinación de una siembra. Deben recordar que este es uno de los requisitos necesarios a un buen medio de cultivo. También en estos medios líquidos, algunas especies bacterianas tienen maneras peculia- res de desarrollarse, como por ejemplo, los organismos muy mo- vibles enturbian muy homogéneamente el medio de cultivo y se ve a simple vista la turbidez de todo el medio; otros, como los aerobios, en la superficie y otros como las bacterias inmóviles, 11 Técnica Bacteriológica forman hilos que se depositan y enmarañan en copos en el fon- do del medio de cultivo. El bacilo de la peste bubónica forma cadenas en la parte superior, que se insinúan hacia abajo como estalactitas. Por estas razones que hemos expuesto, podremos darnos cuenta de que, si no es indispensable, por lo menos es de gran utilidad al bacteriólogo el poder disponer de medios de cultivo clarificados. Para hacer la clarificación de un medio de cultivo pode- mos emplear dos procedimientos, uno que utiliza la albúmina y el otro la filtración. PRIMER METODO: Tomamos clara de huevo, que es la albúmina que más se usa, generalmente hasta una o dos para un litro de cultivo y se le agrega al caldo, disolviéndolo bien por todo él, por medio de batido; entonces se eleva la tempe- ratura y como a los 60° C., se coagula la albúmina, en las ma- llas de esta coagulación, se aprisionarán todos los elementos que enturbian el medio, que en forma de grumos, irán hacia la superficie, donde los podremos extraer fácilmente. SEGUNDO METODO: La filtración debe realizarse en frío, pues en caliente puede ser que alguna de las impurezas que enturbian el medio, se encuentren disueltas y pasen por el papel, mientras que en frío, estas se precipitan en grumos más o menos grandes y de ninguna manera pasarán por el filtro que se utilice. Se hace casi siempre esta filtracción colocando el papel de filtro en un embudo de cristal que en su parte in- ferior tiene un tubo de goma del cual se va repartiendo a los tubos limpios que estarán ya listos para la esterilización. ESTERILIZACION: Aun después de clarificado no pode- mos realizar la siembra, porque nuestras manos, los tubos, el 12 Compendio de Bacteriología mibudo, el papel de filtro, etc. contienen bacterias, que casi con seguridad van a infectar el medio que hemos estado preparan- do, por lo tanto tendremos que destruirlas y para esto es lo que utilizamos la esterilización. El caldo simple se esteriliza al au- toclave, como describiremos más adelante. DISTINTOS METODOS DE ESTERILIZACION POR MEDIO DEL CALOR: Son varios los métodos de esterilización que pueden usarse por medio del «calor: l.° Calor continuo a 110° C. y más, que a su vez compren- de : calor seco, rojo y aire caliente. 2.° Calor húmedo, que a su vez comprende: en agua o¡ acei- te hirviendo, vapor sin presión, autoclave, vapor a presión, va- por de Koch. 3.° Calor discontinuo a 100° C. o menos (Pasteurización, Calor discontinuo de Tyndall). También se utilizan para la esterilización, el filtraje y las sustancias antisépticas, aunque no son de uso corriente en La- boratorio. Se emplean, sin embargo, para determinados tra- bajos. De todos estos procedimientos son los más utilizados la Pas- teurización, el calor discontinuo de Tyndall, el calor rojo, el calor seco (horno de Pasteur) y el autoclave. PASTEURIZACION: Algunos medios de cultivo ricos en albúmina no pueden someterse rápidamente a la temperatura de ebullición del agua sin que se alteren notablemente y pier- dan sus propiedades; en este caso se encuentra el suero de la sangre. Pasteur demostró que puede reemplazarse entonces la ac- 13 Técnica Bacteriológica ción rápida de una temperatura elevada por la de otra de ma- yor duración comprendida entre 55'° y 60° C., que es lo que se conoce con el nombre de pasteurización. A veces hay que com- binar este procedimiento con el del calor discontinuo y repetir la pasteurización. En la pasteurización tenemos que bajar la temperatura rápidamente a un poco más de 0o C. y mantener- la así algún tiempo. MODUS OPERANDI: El líquido que se ha de esterilizar se reparte en varios matraces de cuello largo, previamente lla- meados y llenos hasta sus % partes y se colocan en un baño- maría cuya temperatura se hará subir progresivamente hasta 55° o 57° C. Esta temperatura la apreciamos por medio de un termómetro colocado en ese baño y, una vez conseguido el gra- do que se desee, se regula el mechero de modo que esta tempera- tura se mantenga estacionaria, durante una hora. Después se retiran los matraces y se llevan a una temperatura baja, según hemos dicho. Cada 24 horas puede repetirse esta operación. La pasteurización se emplea con mucha frecuencia en la desin- fección de la leche y la de la cerveza. La leche hervida es una leche muerta para el consumo, por las propiedades fisiológicas que pierde. Es mala de digerir y se conserva por medio de la pasteurización, pues no hierve so- metida a una temperatura de 60° a 80° y aun hasta 84° C. El objeto de que no llegue a la ebullición y después el enfriamien- to rápido es para evitar que los esporos germinen; así tendre- mos una leche buena para la digestión, que no ha perdido sus propiedades biológicas y que no contiene bacterias. Por este procedimiento destruimos la forma vegetativa de la bacteria; sin embargo, no así los esporos y por eso es que la mayor par- te de las veces hay que realizar la pasteurización como el calor 14 Compendio de Bacteriología discontinuo de Tyndall. TYNDALIZACION O METODO DE CALEFACCION DISCONTINUA DE TYNDALL: Es una especie de pasteuri- zación, repetida en varios días sucesivos, y sin bajar la tempe- ratura después de cada calefacción. Consiste en someter el medio de cultivo a 80° C durante una hora y repetir la operación 3 o 4 veces. Se hace esto para que el primer día se destruyan las formas vegetativas bacteria- nas que infecten el medio y, si existiesen esporos, hacerlos ger- minar, de manera que al día siguiente mueran como forma ve- getativa que adoptan. Este procedimiento se utiliza para la es- terilización del Suero de Loeffler y necesita un aparato especial para poderlo realizar. Cuando expliquemos, más adelante, el suero de Loeffler, daremos los detalles del procedimiento. ESTERILIZACION AL AUTOCLAVE : Es la manera más corriente, más rápida y efectiva de esterilización. En ella se hace uso de los efectos reunidos del calor húmedo y la presión. Sin embargo, no todas las cosas pueden ser esterilizadas al au- toclave. Existen varios modelos de autoclaves, natural y fundamen- talmente iguales, entre ellos citaremos el de Chambenland, por ser el más usual, y en el que se efectúa la esterilización en una sola sesión. Este aparato consiste en una cámara cerrada, llena de agua que, al calentarse, produce además de la temperatura de 180° C., una presión de varias atmósferas, hasta cuatro (debemos saber que cada atmósfera corresponde a 15 libras, pues algunos de es- tos aparatos marcan libras) que se marcan con un manómetro colocado en la cubierta del cilindro que forma la cámara cerra- 15 Técnica Bacteriológica da. Se encuentran además en la cubierta del autoclave, un ter- mómetro que nos da la temperatura y una válvula de seguridad, que nos sirve para graduar la presión dentro del aparato. La cubierta del aparato, lo cierra herméticamente por medio de una serie de tornillos que tiene a su alrededor. Para hacer la esterilización, procederemos a poner los tu- bos de ensayo con medio de cultivo, caldo, que es lo que esta- mos explicando, en cestos metálicos y se coloca dentro del au- toclave, que tendrá en su fondo cierta cantidad de agua, que engendra el vapor que aumentará la presión dentro del apara- to ; se cierra la cubierta de ésta lo más fuertemente posible y se encenderá la corona de mecheros Bunsen que se encuentran en la parte inferior. Hecho esto, la temperatura y la presión em- pezarán a aumentar dentro del aparato. Cuando observemos que la presión llega a l1/» atmósfera y la temperatura a 115° o 120°, bastará graduar la válvula de seguridad para mantener esta presión constante. De 20 a 30 minutos la esterilización será completa. Después de este tiempo, dejaremos que el aparato se enfríe lentamente para abrirlo y la operación habrá terminado. Ya el caldo en estas condiciones se encuentra apto para re- cibir una siembra. Tendrá un color amarillo y será perfecta- mente transparente, aunque lo agitemos. VARIEDADES DEL CALDO: Este que hemos visto es el que se llama caldo simple, en oposición a otros que se llaman com- puestos, que consisten en la adición a aquel de sustancias diver- sas, tales como glicerina, azúcares, etc. Estos caldos se usan eventualmente, por ejemplo, para las bacterias anaerobias, que tienen afinidad por los carbohidratos o de bacterias que en pre- sencia de ellos producen gases en distintas proporciones y de es- 16 Compendio de Bacteriología ta manera, nos dan más detalles para su clasificación y diferen- ciación. Un buen ejemplo de esto lo tenemos en la diferencia- ción del bacilo de Eberth (agente productor de la Fiebre Tifoi- dea) y el bacilo coli-comunis; el primero no produce gases en presencia de los caldos con glucosa y sacarosa y el segundo, sí. Estos caldos llevan el nombre distinto según las sustancias que se le agreguen; así tendremos los caldos, glicerinado, lac- tosado, glucosado, etc. Entre estos caldos, tenemos el caldo tor- nasolado, que es un caldo al que se le ha agregado tintura de tornasol, y que nos sirve para apreciar el desarrollo de bacte- rias que producen sustancias ácidas. Existe la llamada solución Dunham, que no es más que una solución de peptona y cloruro de sodio, que se utiliza para investigar la reacción del indo! en las bacterias. La fórmula es: Agua 1000 ce. Cloruro de sodio 5 grs. Peptona 10 grs. 17 LECCION II. Suero Es otro medio de cultivo de empleo frecuente y tiene el privilegio de poderse emplear de dos modos: líquido, cuando se obtiene asépticamente y coagulado o sólido, cuando hay que esterilizarlo. Se utilizan dos clases de suero: uno es el de la sangre y el otro, el que se obtiene de líquidos patológicos, tales como el exu- dado pleurítico, y el líquido de ascitis. Para que el suero pueda usarse como medio líquido tiene que proceder de un animal sano, que no presente infección al- guna. Bastará entonces recojerlo asépticamente, y esperar a que se coagule la sangre. De esta manera el suero es un buen medio de cultivo, líquido, como lo es la leche, etc. Por el contrario cuando el suero procede de un animal que se encuentra en con- diciones patológicas, tendremos que usarlo al estado sólido, pues exigirá entonces una buena esterilización. Debe tenerse en cuen- ta que el suero se coagula a una alta temperatura y que des- pués no vuelve a tomar el estado líquido. 19 Técnica Bacteriológica Este suero fresco contiene sustancias bactericidas, las cua les se oponen a que ¡lo usemos como medio de cultivo. De est manera debemos recordar que no podemos usar el suero recier extraido, sino que hay que dejar trascurrir, por lo menos 24 ho- ras, para que estas sustancias bactericidas (alexinas) se des- truyan. La propiedad más esencial de este medio de cultivo es que dehe tener y conservar una transparencia casi completa; no se puede calentar a temperaturas elevadas, pues ésta determinaría su coagulación en masas opacas. Para conservarlo líquido no debe calentarse a más de 56° a 58° C, pues si se calienta a 70° C, durante dos o tres horas, se coagula y así conserva su transparencia, pues se irá coa- gulando lentamente. MANERA DE OBTENERLO: El suero que más se usa es el de la sangre de animales grandes, y de estos, el del buey y el caballo, pues el suero de líquido pleurítico y de ascitis, son di- fíciles de conseguir en un Laboratorio. Para obtenerlo se va al Matadero y se espera el sacrificio de una res. Es siempre conveniente desechar la primera sangre que brota de la herida de la cual vamos a obtener la sangre. Esta es la forma más corriente de la obtención de la sangre. El suero de caballo es más recomendable que el de res, porque generalmente el de res es un suero contaminado; pero en la práctica corriente, sobre todo en Laboratorios que no son ricos, como el nuestro, resulta bueno el de res. Para recojerlo asépticamente, podemos emplear variados aparatos, entre ellos los de Latapier y el de Lumiere; nos pa- rece recomendable el aparato de Lumiere. 20 Compendió de Bacteriología Se toma la sangre en uno de ellos y se lleva a un lugar frío (en vez de llevarlo a un aparato de refrigeración, es más recomendable ponerlo en un lugar fresco en que se coagule len- tamente; muchas veces ocurre con este cambio intenso de tem- peratura la disolución de la hemoglobina, que comunicaría al suero un tinte rojizo) para que ésta se coagule. Después de esto hay que separar el suero del coágulo. Pa- ra esto usamos un aparato que consiste en un frasco que tiene un tapón que es atravesado por dos tubos; un tubo largo, que comunica con el que contiene el suero y otro más corto por el cual hacemos la succión. Una vez extraído el suero de esta manera, ya no tenemos más que llenar los tubos. Esto lo hacemos por medio de una pipeta estéril y colocamos como ya sabemos, la cantidad de 10 cc. en cada tubo. La dificutad de obtener el suero aséptico hace que no se emplee en estado líquido con tanta frecuencia, aparte de lo fácil que es su descomposición, los sueros que se usan al estado lí- quido son más bien los otros, es decir; los exudados y transu- dados de cavidades serosas. Existen como ya anteriormente dijimos para el caldo, mul- titud de variedades de sueros, los cuales dependen, naturalmen- te de la distinta composición que le hayamos dado a cada uno. Tendremos, pues, el suero glicer inado (6 a 8%), el agar-suero agar-ascitis, agar-sangre, etc. Entre todos estos tenemos uno que es de uso universal que no es1 más que una adición al suero, de caldo glucosado; recibe el nombre de "SUERO DE LOEF- FLER" y es el medio predilecto para el desarrollo del bacilo de la difteria. Por esta propiedad, es utilizado en los servicios 21 Técnica Bacteriológica de sanidad de todas las naciones, para el diagnóstico precoz de esta enfermedad. Sembrado un tubo de este suero, con bacilos diftéricos, a las 12 o 13 horas a 37° C. se puede ver una germi- nación abundante. El suero de Loeffler tiene la siguiente formula: Agua. . 1000 grs. Carne de buey 500 grs. Peptona 20 grs. Sal común 5 grs. Glucosa 10 grs. Este caldo glucosado, se une en proporción de 1 a 3 con el suero de res. Tendremos pues: Suero de res 3 partes. Caldo glucosado 1 parte. ESTERILIZACION DEL SUERO: Cuando ya el suero está puesto en los tubos de ensayo, tenemos que proceder a su este- rilización y ésta hay que efectuarla en un aparato especial que se conoce en los Laboratorios con el nombre de aparato de Koch. Este aparato de Koch nos asegura, además de la Tynda- lización que es el modo como tenemos que esterilizarlo, la posi- ción oblicua que debe conservar en un tubo de ensayo, todo me- dio solido de manera que así tenga más superficie para el desa- rrollo bacteriano. DESCRIPCION DEL APARATO DE KOCH: El aparato que se usa es el de Koch, modificado. Se compone de una caja rectangular de cobre de doble pa- red, montada sobre piés de hierro sobre los cuales la caja puede rodar y adoptar posiciones más o menos inclinadas. El espacio 22 Compendio de Bacteriología de la doble pared se llena de agua; en el interior de la caja se eoloca una capa de arena fina sobre la cual se echan los tubos con el suero y un termómetro. Además tiene una tapa compues- ta de dos láminas de vidrio fijas en un marco metálico y sepa- radas entre si mediante una delgada capa de aire. En la parte superior de la cámara cerrada tiene una abertura, en la cual se encuentra un tapón de goma, atravesado por un termómetro, que permite conocer la temperatura del agua que en ella se en- cuentra y en la parte lateral, tenemos un tubo de vidrio que se comunica también con la cámara cerrada que permite conocer la cantidad de agua que se encuentra en el aparato. En la parte inferior lleva una serie de mecheros para gas que son los que aumentan la temperatura en el aparato. MODUS OPERANDI: Echamos en los tubos de ensayo, como hemos dicho, 10 ce. de suero en cada uno; los depositamos so- bre la fina capa de arena que se encuentra en el fondo de la caja, disponiendo la caja con una inclinación suficiente para que el medio tome la mayor superficie que pueda, teniendo cuidado de que no toque el algodón que tapa el tubo. Se coloca agua en la cámara cerrada y se cierra la caja. Encendemos en- tonces él o los mecheros Bunsen que presenta el aparato en su parte inferior y llevamos la temperatura a 80° C. por el termó- metro que se encuentra al exterior, observando de cuando en cuando el estado de la gelatinización de ios tubos sometidos a la operación y cuando esta se halla efectuado completamente, po- demos apagar los mecheros. A las 24 horas, volvemos a hacer lo mismo y así podemos repetir la esterilización por dos o tres días seguidos.La primera elevación de temperatura nos asegu- rará la coagulación del suero; la segunda destruirá las formas vegetativas que se encuentran y hará germinar los esporos y la 23 Técnica Bacteriológica tercera, acabará con las formas vegetativas que germinaron el día anterior. Debe colocarse dentro del aparato, una caja de Petri, llena de agua para reparar la falta de ésta dentro del aparato. 24 LECCION III. Lec^e. Este es otro medio de cultivo de uso frecuente. PROPIEDADES: Puede decirse que es un medio natural muy bueno, ya que contiene elementos orgánicos, que son favorables al desarrollo de las bacterias tales como la albúmina, azúcar (lactosa) y además la reacción que es bastante alcalina para el cultivo. Pero no sucede aquí como en el suero, porque es ca- si imposible obtener una sola muestra de leche que no contenga bacterias por lo que hay que esterilizarla y esto tiene que ser por pasteurización. El color es blanco, pero corrientemente se le echa tintura de tornasol que le da un color azulado. Esta tintura se le echa, para observar el cambio de reacción del medio, durante el desa- rrollo de las bacterias. La leche contiene una sustancia, la caseína, que no ha po- dido obtenerse sintéticamente y que en algunas circunstancias la hacé muy ventajosa sobre otras. Esta caseína favorece en al- to grado el cultivo, sobre todo de las bacterias fermentecibles. 25 Técnica Bacteriológica Nos sirve la caseína para diferenciar algunas especies de bac- terias, según la coagulen o no. Dos inconvenientes tiene la leche como medio de cultivo: en primer lugar que no es transparente y en segundo Jugar que contiene una gran cantidad de grasa, circunstancia esta que perjudica en general el desarrollo bacteriano, con la excepción del bacilo butírico, para el cual es un gran medio. MANERA de OBTENERLA y MANIPULACION PA- RA USARLA: La leche debe ser fresca y puede obtenerse asépticamente, lavando la glándula mamaria de la vaca con una solución de sublimado corrosivo (Cl2 Hg), y repartiéndola des- pués en frascos esterilizados. Es conveniente quitarle la grasa a la leche antes de usarla, porque en primer lugar, impidirá el desarrollo de las bacterias aerobias, porque acumulándose en la parte superior no permi- tirá que las bacterias en ella sembradas puedan proveerse de gran cantidad de oxígeno que necesitan y segundo, porque mu- chas veces, al hacer las siembras, la grasa se adherirá a la aguja con la que se va a efectuar esta y no deja libertar la semilla. Para desengrasarla, hay que colocarla en un recipiente frío y después con un sifón o una pipeta, se extrae la que se encuen-' tra en el fondo del recipiente, pues la grasa tiende a ocupar la parte superior. Hecho esto, sólo tenemos que llenar los tubos que van a ser sembrados. Algunas veces sucede que la leche no se encuentra con reac- ción alcalina, sino ácida, en este caso tenemos que agregarle al- gún alcalino. Después de esto sólo tenemos que proceder a su esterili- zación y para esto sabemos que no debemos usar el autoclave 26 Compendio de Bacteriología (pues coagularía su albúmina y haría perder a la leche su po- der nutritivo) sino la pasteurización que puede «combinarse con el procedimiento de calefacción descontinua de Tyndall. SANGRE: La sangre se emplea con frecuencia como medio de cultivo. Para usarla al estado líquido, hay que impedir su coa- gulación, desfibrinándola. Para esto, debe extraerse lo más asép- ticamente posible, verterse en un frasco que haya sido esterili- zado, que contenga esferitas de vidrio, debe agitarse durante unos 10 minutos, aspirar más tarde el líquido resultante y re- partirlo en sus tubos. Para evitar la coagulación de la sangre puede emplearse cualquier solución que encuentren formulada en los textos que sea a base de citrato neutro de sodio. Existen actualmente los medios de caldo-sangre y agar-san- gre, los cuales han adquirido preponderancia en cuanto se re- fiere a los cultivos de bacilos de influenza (Pfeiffer) y en gono- coco (Neisser). ORINA: Fué muy utilizada al principio de las investigaciones bacteriológicas para cultivar la bacteridia carbunclosa y el go- nococo (adicionándole %% de peptona), pero su uso se ha abandonado completamente. HUEVO: Pueden emplearse al estado sólido o líquido. Siem- pre son asépticos, habiéndose cultivado en ellos el bacilo colé- rico. Para usarlo, se lava la cascara con sublimado, se punciona por uno de sus polos (pasándose antes por la llama), se depo- sita la semilla y después de taparlo con una tapa de colodion, se lleva a la estufa. De este modo se ha tratado de cultivar el bacilo de la lepra. INFUSIONES VEGETALES: Se han preconizado los cocí- 27 Técnica Bacteriológica mientos de plantas, ej. agua de heno, de patata, etc. macerán- dolas y llevándolas a la ebullición, después se filtran y esterili- zan. Han dado poco resultado en el cultivo bacteriano. PATATA: Casi todos los tubérculos son excelentes medios de cultivo para las bacterias, especialmente para las cromógenas, como esta que describimos lo son también la yuca, el ñame, la malanga, etc. que son todas ricas en carbohidratos. De todos estos el más usual es la patata. Emplease de dos modos: uno es ehde las cajas de Petri, en las cuales puede emplearse en estado natural o en el de puré, el otro, es al estado natural en tubos de ensayo especiales para patatas o tubos de ROUX. PROCEDIMIENTO DE LOS PLATILLOS DE PETRI: Pre- feriremos papas grandes, que estén sanas, se lavarán con agua, frotándolas con un cepillo, para quitarle la tierra que puede contener esporos, que germinarían rápidamente. Después se de- jan secar, se pelan, se cortan en sentido perpendicular al eje mayor y se colocan en agua destilada. Debe evitarse el tocar la patata con los dedos durante esta manipulación, al mismo tiem- po que debe usarse un cuchillo de plata, para que al pasarse por la llama no se ennegrezca con el humo. Debemos evitar tam- bién la germinación de hongos; pues la reacción de este tubér- culo, es naturalmente alcalina y se torna fuertemente acida por esta clase de germinación. En caso de que esto ocurra tendre- mos que colocarla en una solución de potasa caústica muy débil hasta que esta reacción desaparezca. Entonces se secará el tubérculo con un papel de filtro. Coloca- remos los trozos de papas en las placas de Petri, las cerraremos y por último se llevan al AUTOCLAVE, donde se esteriliza- 28 Compendio de Bacteriología rán a 120° C. durante veinte minutos. PROCEDIMIENTO DE LOS TUBOS DE ROUX: Al principio no variará en nada la técnica, solamente en la manera como se ha de cortar, esto será, en forma cilindrica, para lo cual existe un aparato que es un molde que las corta en pedazos que tienen esta forma. Después se cortan con un cuchillo de manera que tomen la forma de un pico de flauta. Los tubos que se utilizan para esta clase de medio de cul- tivo, tendrán una estrangulación en la parte inferior, como a tres o cuatro centímetros cerca del fondo, y serán más largos que los que se usan ordinariamente. En la ampolla que de esta manera se forma en la parte inferior del tubo, se colocará más tarde el agua que mantendrá al medio en buenas condiciones de humedad. Debemos no cortar los pedazos de patata demasiado largos, porque al esterilizarse tienen tendencia a doblarse. Después de lavados los pedazos de patata; los introducimos en los tubos, echamos una cantidad de agua en el ámpula del fondo y podemos llevar ya los tubos al autoclave, donde se es- terilizarán de la misma manera que hemos expuesto anterior- mente. Caso de presentar antes de esto la papa una reacción acida, debemos sumergirla en una solución al 5 o 10% de sosa. Es muy corriente el uso de la patata glicerinada (al 1 o 2%) para el cultivo del bacilo del muermo, donde el puede ger- minar en un tiempo relativamente corto, pues a las 24 horas ya aparecen las colonias oue toman un color carmelita. En este me- dio, así como en el agar-gl'cerinado. se puede cultivar el bacilo de la tuberculosis. La patata en forma de puré se usa muy excepcionalmente. 29 Técnica Bacteriológica La técnica es idéntica que para la elaboración de los dos medios anteriores 30 LECCION IV. Agar-agar y Gelatina. El agar-agar, es una sustancia gelatinosa que se obtiene de un alga del Mar de la India (Gelidium Amansis, espiriformis, polycladum, etc. orden de las floridias. GOMEZ PAMO). Fué estudiada e introducida en Bacteriología por Pyen. Es amorfa, isómera de la celulosa, dura y cornea en estado seco; se hincha y disuelve en agua hirviendo, se solidifica por enfriamiento como la gelatina y por si solo es poco nutritivo, teniendo que serle añadido para que cumpla sus funciones, caldo simple. En el comercio se le encuentra, o bien en forma de fibri- llas laminares secas o de polvo. La gelatina es una sustancia muy parecida al agar-agar, que se obtiene, de los tendones y ligamentos de los animales. Fué introducida en Bacteriología por Cock, bacteriólogo ale- mán. Se solidifica por enfriamiento y es dura, se funde de los 35 a 40° C. (Debemos recordar que el agar-agar, lo hace a los 100° C.) La gelatina que se encuentra fabricada en los Labora- torios no es más que un caldo al cual se le ha agregado un 20 o 31 Técnica Bacteriológica 25% de gelatina. De por si la gelatina es menos nutritiva que el agar-agar, por lo tanto hay que agregarle siempre el caldo. El agar-agar se considera como una gelatina de origen vegetal. PREPARACION: Tenemos que preparar un caldo previamen- te, para la fabricación de ambos. Después sólo tenemos que ver la cantidad de agar-agar o gelatina que se le ha de agregar. Pa- ra cada uno de ellos necesitamos una cierta proporción que es la que le va a dar al medio la consistencia que deseamos. Para el agar-agar, corrientemente se usa de 15 a 20 gramos para el litro, es decir de 1% a 2%. De la gelatina hay que utilizar una cantidad mucho mayor, que será de un 8 a un 15% o sea de 80 o 150 gramos por litro. Es necesario variar la cantidad de gelatina según la época del año, aumentando su concentración en el verano, disminuyéndola en el invierno. La neutralización tanto de uno como del otro modo será he- cha, por adición de sustancias alcalinas, (hidrato de potasio, por ejemplo) por alguno de los métodos que ya conocemos. La gelatina y el agar, ambos tienen naturalmente una reacción áci- da por lo tanto es imprescindible que la neutralización se lleve a efecto. Hacemos la clarificación de estos medios, operación tam- bién que debemos realizar siempre, sobre todo en el caso del agar-agar, por el procedimiento de la clara de huevo. La filtración de estos medios tiene que efectuarse en ca- liente, requisito necesario, porque se solidifican rápidamente ambos medios. EMBUDOS PARA FILTRACIONES EN CALIENTE: Está constituido por un embudo de cobre montado sobre un trípo- de de hierro, dentro del cual se aloja otro embudo de cristal 32 Compendio de Bacteriología cuya parte más estrecha se adapta a la de aquél por interme- dio de un tapón de caucho; por un tubo lateral se echa el agua hasta llenar el espacio comprendido entre las paredes de los dos embudos y se calienta por medio de un mechero Bunsen co- locado bajo un apéndice, que lleva el embudo de cobre en su parte lateral e inferior. Debe evitarse el que hierva el agua en el embudo metálico, para que esta no se proyecte por el tubo por donde se llenó; además es necesario, calentar el embudo an- tes de verter en él la gelatina, para que ésta se encuentre a temperatura conveniente y no se solidifique al ponerse en con- tacto con las paredes frías del embudo. Esta manera simplifica mucho la filtración de ambas sus- tancias, porque en lugares donde no se dispone de este embudo, tenemos que estar constantemente, calentando el agar-agar y la gelatina, antes de llevarla al filtro. Después de esto, solamente tenemos que ir llenando los tu- bos, (aproximadamente 10 ce en cada tubo) cosa que podemos hacer, conforme se va verificando la filtración. Procederemos entonces a la esterilización que será hecha en el autoclave, a 110 o 115° C. durante veinte minutos. Extraídos los tubos del autoclave, tenemos que dejarlo soli- dificar, pero debemos colocarlos inclinados para que como hi- cimos con el suero adquiera la mayor superficie para el desa- rrollo bacteriano. VENTAJAS DEL AGAR-AGAR SOBRE LA GELATINA Y VICE-VERSA: La gelatina es más transparente que el agar- agar. El agar-agar, se funde a 100° C. y la gelatina lo hace a los 45°, por esta razón las bacterias que tienen una temperatura óptima elevada, no pueden ser sembradas en gelatina. Además 33 Técnica Bacteriológica la gelatina, una vez que se ha licuado, va disminuyendo su pun- to de fusión (de 4 a 6 grados de una vez a otra) y hasta llega a perder la propiedad de volver al estado sólido. El agar-agar, puede usarse en aquellas prácticas de Laboratorio que exijan la transformación sucesiva de este medio de sólido a líquido, no así la gelatina. El agar-agar es más nutritivo que la gelatina, pero ésta es más pura que aquel y nunca tenemos que desperdiciar nada de ella. La gelatina nos sirve para diferenciar las especies bac- terianas en liquefacientes y no-liquefacientes, según la li- cúen o nó. 34 LECCION V. Diferentes Métodos poro la Siembra de Bacterias Recibe el nombre de siembra, en Bacteriología, la fertiliza- ción de un campo cualquiera, (medio de cultivo) con una se- milla (bacteria) para facilitar o coadyuvar a su desarrollo y poder estudiar sus propiedades biológicas. Pueden practicarse las siembras, bien partiendo de un cul- tivo hecho previamente o tomándolo directamente de otro lugar como por ejemplo agua, sangre, pus, etc. La técnica de las siembras es única y solamente reciben distintos nombres, según la forma como ésta se verifique. En cualquier clase de siembra que se lleve a efecto, tenemos que tener en cuenta tres operaciones fundamentales, que son: l.° Apertura del tubo donde está el cultivo objeto de la siembra o toma del material de una lesión u otro elemento que contenga la semilla. , 2.° Manera de tomar el material. 35 Técnica Bacteriológica 3.° Transporte de este al medio donde se desea cultivar. Por lo que liemos dicho precedentemente, podemos juzgar, los materiales que necesitaremos para hacer la siembra; estos serán: el medio de cultivo infectado o la lesión rica en elemen- tos cultivables, la aguja de platino, un mechero de alcohol o uno de Bunsen y un tubo o placa de Petri con medio de cultivo estéril para recibir la semilla. Las agujas de platino, pueden ser de tres clases, según la forma que adopte su terminación, y serán, recta, en asa o curva y en espátula. Las siembras deben verificarse en un lugar cerrado, que tenga poca ventilación, para eso en todos los buenos I aborato- rios de Bacteriología habrá un cuarto pequeño, cerrado y semi- obscuro, especialmente empleado para las siembras. Debe tenerse cuidado con la toma del material que ha de sembrarse, sea un cultivo hecho ya o una lesión, pues estamos expuestos a provocar, si el material es muy virulento, una in- fección accidental, probablemente no en nosotros mismos s'no en nuestros compañeros de trabajo que si no presencian nues- tro descuido tocarán confiadamente los lugares infectados. La aguja de platino que se emplee debe siempre esterili- zarse antes de ponerla en contacto con este material, y esto lo hacemos, colocándola a la llama del mechero Bunsen y lleván dola al calor rojo. Debemos tener cuidado en dejar transcurrir un tiempo prudencial entre esta esterilización y la introducción de ella ail material a cultivar, pues muchas veces sucede que des- truimos la semilla con la aguja caliente antes de sembrarla y la operación será un fracaso. Después de tomado el material, tenemos que transportarle al lugar que se ha de sembrar y en esto también tenemos que tener cuidado y hacerlo rápidamente pues son muchas las va 36 Compendio de Bacteriología piedades de bacterias que se encuentran en los objetos a nues- tro alrededor, esperando caer en un medio propicio para desa- rrollarse y en este caso también habremos fracasado, pues el es- tudio de las especies microbianas se base en la obtención de cul- tivos puros. Debemos siempre flamear los tapones de algodón de los tu- bos después de cerrados. Cuatro son los métodos más corrientes empleados en Labo- ratorio y son: l.° Siembra por estría. 2.° Siembra por punción. 3.° Siembra por agua de condensación; y 4.° Siembra por hisopo. SIEMBRA POR ESTRIAS: Se puede hacer en un plati- llo de Petri, en un tubo de agar inclinado, etc., en cualquier medio sólido. Cuando hacemos las estrías en una placa de Petri, toma- mos el tubo objeto de la siembra, con la mano izquierda, con la derecha, la aguja de platino, llevamos el algodón que obtura el tubo, a la llama del mechero y hacemos lo mismo con la agu- ja de platino hasta que esta tome un color rojo. Entonces, con la misma mano que sostenemos la aguja de platino, y con los dedos pulgar e índice, abrimos el tubo que se encuentra infec- tado, por medio de un movimiento lijero de torsión. Introdu- cimos la aguja que ya se ha enfriado en el tubo y tomamos una pequeña cantidad de material infectante, teniendo cuida- do al retirarla, de no tocar con ella ni las paredes, ni la boca del tubo, entonces obturamos este tubo, quitamos la tapa del platillo de Petri y deslizamos suavemente la aguja sobre la su- 37 Técnica Bacteriológica perfieie del agar que en el se encuentra. Generalmente se ha- cen tres o cuatro estrías. Cuidaremos de flamear otra vez la aguja después de retirarla del platillo de Petri y la operación habrá terminado. Este procedimiento lo utilizan los americanos para el ais- lamiento de bacterias. En la primera estría habrá una gran germinación, que se irá haciendo menos profusa, según el nú- mero de estrías que se hagan. La técnica variará ligeramente cuando hacemos la siembra en un tubo de agar inclinado. Tomamos en este caso ios dos tu- bos en la mano izquierda y después de tomado el material con la aguja que tenemos en la mano derecha, flameamos el algodón que cierra el tubo estéril y haremos una estría a lo largo de la superficie del agar. Después de hecho esto debe llevarse el plato de Petri o el tubo, marcado con el nombre de la bacteria que se siembra y la fecha de ese día, a la estufa a 37 o 37^° C. Las bacterias se desarrollan en colonias superficiales a lo largo de estos surcos. Este método de siembra se utiliza sobre todo en los casos en que no disponemos de medios muy transparentes. Es el método más corriente de s iembra en la práctica de la Bacteriología. SIEMBRA POR HISOPO: Se emplea en la papa y en el suero, especialmente en el suero de Loeffler. Se esteriliza bien un hisopo y una vez impregnado con el material de la semilla, se pasa por la superficie del medio de cultivo. No es un método muy empleado, porque el hisopo arras- tra mucha cantidad de material, y la siembra resultará dema- 38 Compendio de Bacteriología siado profusa. Es indispensable su uso, por lo práctico que es, en el caso del diagnóstico precoz de la difteria. Nosotros sabemos, que el suero de Loeffler es el medio por excelencia, para el desarrollo del bacilo diftérico, que varios gérmenes sembrados en él junto con bacilos de Loeffler tardan dos o tres días en germinar, mientras qué el lo hace en 12 o 14 horas. Para esta operación necesitamos un hisopo estéril que podremos obtener en la Se- cretaría de Sanidad y un tubo de Suero de Loeffler. Pasamos el hisopo por la garganta del supuesto enfermo, lo introduci- mos en el tubo y lo llevamos a la estufa, a 37° C. de tempera- tura. A las 12 o 14 horas, veremos el estado de la germinación y tomaremos de allí, para los exámenes microscópicos que que- rramos hacer para comprobar la germinación, que serán: una gota colgante, una coloración simple, preferiblemente por el Azul de metileno y una coloración de Gram. De este modo se hace el diagnóstico bacteriológico de la difteria. SIEMBRA POR PUNCION: También se llama siembra por picadura. Es muy frecuente su uso en gelatina y agar-agar, pero más en la gelatina, que por su transparencia permite ob- servar perfectamente, el desarrollo de las colonias que se en- cuentran en un surco profundo interior. Se toma un tubo, dentro del cual hemos fundido gelatina o agar-agar y antes que se solidifiquen, colocando el tubo en posición vertical, tomamos el material con los cuidados que ya sabemos e introducimos la aguja por el centro del medio de cultivo y la agitamos en su interior. Puede hacerse la siembra por punción en estos medios, aun después que se hayan solidi- ficado, pero a veces de esta manera, es difícil que el material que contiene la aguja se desprenda y se desarrolle en perfectas 39 Técnica Bacteriológica condiciones. En la gelatina se siembran los organismos simógenos, por ejemplo, el estafilococo piógeno dorado, que se desarrolla a la temperatura del medio ambiente, a las 24 horas veremos que allí licúan la gelatina en forma de conos invertidos y además veremos su color característico. Otros organismos también li- cúan la gelatina, pero de distintos modos, como por ejemplo el vibrión colérico, que también la licúa y su germinación toma, macroscópicamente la forma de un clavo de herradura. La punción nos permite muchas veces saber las bacterias que son movibles, pues podemos ver como las colonias emigran hacia la superficie o se dirigen hacia el fondo. En la observación del desarrollo de las colonias, a lo largo de la picadura, podemos obtener detalles que nos orienten ha- cia el diagnóstico de la especie que estudiemos, por ejemplo, unas se desarrollan uniformemente a lo largo de la picadura, otras en forma de embudo, otras con ramificaciones radicula- res, etc. La licuefacción de da gelatina, es una verdadera digestión realizada por las diastasas segregadas por los microorganismos. SIEMBRA POR AGUA DE CONDENSACION: Este otro método consiste en tomar un tubo que contenga bastante agua de condensación en su fondo. Se toma la aguja de platino, se esteriliza, se toma el material que da la semilla, y luego sin to- car la superficie del cultivo, llegamos al fondo y agitamos la aguja dentro del agua de condensación, que naturalmente se infectará. Entonces, retiramos la aguja, cerramos el tubo, y lo colocaremos oblicuamente, es decir acostado, para que esa 40 Compendio de Bacteriología agua de condensación, infecte todo el medio. De esta manera se obtienen colonias muy profusas. 41 LECCION VI. Cultivos de Anaerobios Para el cultivo de anaerobios, se escogen o prefieren, me- dios de reciente preparación y que sean ricos en carbohidratos, debiendo agregársele de estas sustancias a los medios de culti- vo, en proporción de 1 a 2%. Se utiliza mucho para esta clase de cultivo, la glucosa. Las bacterias anaerobias, al igual que las aerobias, aunque tal se les llama, necesitan siempre de una determinada cantidad de oxígeno para su vida, pero como no pueden desarrollarse en presencia de aire, tienen necesidad de obtenerlo, de la descom- posición de las sustancias nutritivas, que contiene el medio de cultivo en que vegete y para facilitarles esa provisión de oxíge- no es por lo que le adicionamos un carbohidrato que lo desdo- bla por fermentación y utiliza su oxígeno. Ciertos anaerobios, germinan en las capas inferiores de los líquidos nutritivos, sin que sea necesario hacerles el vacío a los recipientes que los contienen. Pero no todos los anaerobios pue- den resistir estas condiciones. 43 Técnica Bacteriológica Liborius, (bacteriólogo alemán) ha preconizado el cultivo de los anaerobios en las capas profundas de los medios de cul- tivo sólidos, particularmente en el agar-peptonizado. Los distintos métodos de cultivo de anaerobios, se basan en alguno de estos cinco fundamentos: PRIMERO: Consiste en la extracción del aire, al tubo o frasco que contenga el medio de cultivo. SEGUNLO : Exclusión del aire, para lo cual se interpone una valla entre el aire exterior y el medio de cultivo. Por ejem- plo, esa valla puede ser una película de vaselina, aceite, etc. TERCERO: Absorción del oxígeno, que se hace por me- dio de sustancias químicas que tengan gran afinidad por el. CUARTO: Asociación microbiana, esto es, sembrando con el anaerobio, un aerobio que consuma todo el oxígeno. QUINTO: Sustitución del aire por otro gas inerte, que no tenga oxígeno libre y que no afecte el desarrollo de las bac- terias. Siguiendo el orden de su enumeración haremos el estudio de todos ellos. METODO DE LA EXTRACCION DEL AIRE: Este fué el primer método empleado, siendo Pasteur quien lo utilizó, cuando descubrió el primer anaerobio. Consistía en extraer el aire de los tubos u otros recipien- tes en que estaban sembradas las bacterias, haciéndoles el vacío, bien por, medio de una máquina neumática o la tromba de agua. Pasteur utilizó una máquina neumática. La tromba de agua da un vacío menos perfecto que la máquina neumática. 44 Compendio de Bacteriología He aquí el modelo de una máquina neumática empleada en Bacteriología: Se compone de un tubo en T, que por uno de los extremos del tubo horizontal, se une a la máquina neumática y por el otro, al recipiente que contiene el medio de cultivo. El tubo vertical, se sumerge en una cuba de mercurio, hace de baró- metro y nos permite apreciar el vacío. Pasteur y su discípulo Roux introdujeron al método una modificación, inventando unos tubos que permiten extraer mejor el aire, pero se tropezó con la dificultad de que los tubos, para tener que ser usados por una vez, resultaban muy caros. Otros más cómodos y más baratos han sido ideados, entre ellos el de Pasteur y su modificación. TUBO DE PASTEUR: Con este aparato pueden hacerse dos cultivos sucesivos, practicando las resiembras al abrigo del aire. Está constituido por un tubo en U invertida, de cada una de cuyas ramas sale una tubuladura estirada, llevando en la parte convexa de la U otra tubuladura más ancha y con su ta- pón de guata, entre dos estrangulamientos. l a modificación consiste en no emplear un tubo en U, sino un solo tubo que de una de sus partes laterales, sale una tubuladura. Tiene el mis- mo fundamento que el anterior, pero es mucho más sencillo. En el primer tubo de Pasteur se procede de la siguiente manera, se rompen los extremos de las tubuladuras, primero una y después la otra, por una de ellas, se aspira el caldo o medio líquido que se ha sembrado, en el otro se coloca un testigo de1 mismo medio, es decir sin sembrar, esta operación se hace, per medio de la succión por el tubo superior. Una vez llevados los dos medios a los tubos, se cierran los 45 Técnica Bacteriológica extremos de las tubuladuras y se conecta, la parte superior con una trompa para enrarecer el aire. Cuando se han practicado dos o tres lavados, se cierra este tubo por uno de los estrangu- lamientos que tiene y puesto verticalmente, para tener cuidado de que no se contamine el testigo, se llevan a la estufa. Des- pués se puede ir observando el desarrollo del cultivo. Este procedimiento y todos los otros que tienen el mismo fundamento que el, no se practican hoy en día, pero sin embar- go tienen un gran interés histórico. METODO DE LIBORIUS: El fundamento de este método consiste en agregar al medio, una sustancia que sea muy oxi- dable y susceptible de absorber oxígeno. Véase la fórmula del medio de Liborius: Agar-agar 1000 gramos. Glucosa 20 gramos. Sulfoindigotato sódico 1 gramo. Se siembra en este medio de cultivo, (por punción) en es- tado líquido, en caliente, removiendo bien la aguja, para que se reparta por el medio, y luego lo dejaremos solidificar, vere- mos como de esta manera, germinan los anaerobios en las capas profundas del medio de cultivo. Luego para recogerlos corta- mos con una lima el frasco al nivel de la superficie superior del medio de cultivo y lo extraemos y colocamos en una caja de Pe- tri y para llegar a dicha colonia, cortaremos el agar, hasta lle- gar a olla. METODO DE LA EXCLUSION DEL AIRE: Se toma agar-agar o gelatina y se tiene preparado o fundido otro medio de cultivo que verteremos sobre aquel, quedará en su parte su- perior y al enfriarse, formará un sello o película, que aislará 46 Compendio de Bacteriología completamente al primer medio del contacto del aire. Algo análogo se puede efectuar con el caldo, aunque en este caso será otro líquido, que no se una con el medio, como por ejemplo, aceite, vaselina líquida, petróleo, siempre que ocupe sobre el caldo un espesor suficiente. Así se obtiene fácilmente, el bacilo tetánico. Basándose en este principio de exclusión de aire se han ideado muchos procedimientos de cultivos, pero todos son de menor importancia que el que se ha expuesto, que se usa espe- cialmente para el cultivo del bacilo tetánico. METODO DE LA ABSORCION DEL OXIGENO: Este método se funda en la utilización de sustancias químicas que se combinen con el oxígeno. El más usado de todos los métodos que descansan en este fundamento es el método de Büchner, que consiste en hacer una siembra, al aire, en un tubo pequeño, que se tapará con algo- dón no hidrocilo, el cual se introduce en otro tubo, mucho más grande. Este tubo grande, tiene un soporte en su fondo que no permite que el tubo pequeño, se ponga en contacto con él. Después, hacemos llegar al fondo del tubo mayor, una disolu- ción de ácido pirogálico, que contenga un gramo de este cuerpo y otra de potasa caústica (10 cc. de sol al 10%), esta mezcla, que es fuertemente reduetora, librará de oxígeno al ambiente en que se encuentra el tubo sembrado. Büchner cultivo por este pro- cedimiento el Vibrión Séptico de Pasteur. Existe un aparato, que es el de Turró que consiste en un tubo, que se afina en su parte superior. Esta parte superior, que es más fina, está rodeada por un matraz, que está destina- do a recibir la mezcla reductora, sin poder ponerse en contacto 47 Técnica Bacteriológica con el tubo primitivo, el cual está destinado a recibir el cultivo. Por lo que se ha explicado, fácilmente se puede deducir como se utiliza. Después de vertida en el tubo el medio de cultivo y sembrado y en el matraz, la solución reductora, se cierra bien con un tapón de caucho y se parafina. Se llevará después a la estufa. Este método tiene la ventaja sobre el anterior que per- mite la observación directa ded medio de cultivo, cosa que no puede hacerse en el aparato de Büchner. Kitasato recomienda agregar al agar peptonizado, sustancias muy oxidables, tales como el formiato de sosa, pirogalato de potasio, etc. METODO DE LA ASOCIACION MICROBIANA: Se ba- sa en el aprovechamiento del oxígeno libre por los aerobios, que dejarán vivir y desarrollarse los anaerobios que vamos a estu- diar. Se colocan en un tubo de ensayo cualquiera, unos 10 cc. de agar, se hierve y se enfría rápidamente. La siembra del anae- robio se hace por picadura. Se vierte después en el agar una pequeña cantidad de gelatina líquida, se deja enfriar y verte- mos en esa gelatina algunas gotas de cultivo de aerobio, como por ejemplo del bacilo Subtilis. Tapamos el tubo con algodón y lo llevamos a la estufa a 38°. El aerobio consume todo' el oxí- geno y se desarrolla bien. Esta falta de oxígeno es la con- dición ideal para el anaerobio, que se desarrollará bien. En ese momento el aerobio perecerá y podremos estudiar el anaerobio. Este método se lleva a efecto, cerrando el tu- bo herméticamente en la mayoría de los casos, por lo que pre- senta el inconveniente de que tenemos que romperlo cuando quebramos hacer estudios sobre él, por eso Salomonsen ideó el usar dos tubos uno grande y otro pequeño, en uno siembra el 48 Compendio de Bacteriología anaerobio y en el otro, el aerobio, sembrado en gelatina. En es- tes procedimientos, la bacteria aerobia hace el papel de sustan- cia oxidable, cine roba oxígeno al medio. Es muy fácil de demostrar las diferentes necesidades de las bacterias, para ello basta ver un medio sólido sembrado, por ejemplo; con bacilos del carbunclo, que tiene gran afinidad por el oxígeno. Germina abundantemente en la superficie de la ge- latina y el vigor de esta germinación, disminuye a lo largo del surco de la picadura a medida que se aleja de la superficie; el bacilo de la septicemis de las ratas, al contrario como el anaero- bio, no se desarrolla en la superficie de la gelatina, pues es en la parte más profunda del surco donde sus colonias alcanzan mayor vigor. De modo que los aerobios, al desarrollarse en la gelatina forman un cono de vértice inferior, los anaerobios, un cono de vértice superior y los discrecionales o facultativos, un cilindro, de igual diámetro en las capas superficiales que en las profundas. Estos métodos descritos se usan poco en la práctica. METODO DE LA SUSTITUCION DEL AIRE POR UN GAS INERTE: Este gas que sustituye al aire, no deberá tomar oxígeno de lado alguno, ni deberá afectar en nada el desarrollo de las bacterias. Generalmente es el método que más se sigue en todos los Laboratorios. Es el hidrógeno, el gas que más se utiliza para sustituir al aire, en los métodos que tienen este fundamento. Se usa el recipiente de Novy, adicionado de un generador de hidrógeno y de un frasco lavador, constituyendo el aparato de Kipp. En el recipiente, se colocarán los tubos que se han sem- 49 Técnica Bacteriológica brado. Este recipiente tiene en su tapa, unas rodajas de goma que permitirán su cierre perfecto. En su parte superior tiene dos tubos que se comunican con la cámara interior, uno de los cuales va a la cristalizadora y el otro viene del frasco lavador, que contendrá una solución de permanganato de potasio. Este frasco lavador está conectado también por un tubo con el apa- rato generador del hidrógeno. Este hidrógeno se produce en es- te aparato, por procedimientos químicos comunes, bien con áci- do sulfúrico y Zinc o ácido clorhídrico y Zinc. Cuando el apa- rato comienza a trabajar, veremos que por el tubo que está en comunicación con la cristalizadora, empiezan a salir burbu- jas de aire. No es el hidrógeno el gas inerte que solamente puede usar- se, sino también el nitrógeno y el gas del alumbrado y para aquellas bacterias que no sean anaerobias estrictas, puede usar- se también el CO2, recomendado y usado por Pasteur. Existe un procedimiento, indicado por Roux, que consiste en hacer pasar una corriente de gas al través de gelatina fun- dida, que más tarde se siembra con el anaerobio que estudie- mos. Cuando todo el aire ha sido extraído se cierra el tubo y se pone a incubar y pronto veremos el desarrollo de las colo- nias bacterianas. Método de Fraenkl: Se emplea un tubo de ensqyo grande, de los de Esmarch, que tiene una tapa de goma con dos aguje- ros, para el pase de dos tubillos finos, de los cuales, tino es lar- go, pues llega hasta el fondo del tubo y el otro es corto. En el tubo de Esmarch pondremos una cantidad conveniente de ge- latina o de agar, esterel izamos el tubo y sus accesorios, luego sembramos y por el tubo largo haremos pasar una Garriente de hidrógeno, que irá sustituyendo al aire que se encuentra dentro 50 Compendio de Bacteriología del tubo grande. El aire irá saliendo por el otro tubo, es decir, el más pequeño. Cuando todo el aire ha sido sustituido, cerra- remos ambos tubos y llevaremos el aparato a la estufa. En vez de hidrógeno puede usarse el gas del alumbrado y el óxido de carbono. 51 LECCION Vil. Métodos de aislamiento de Bacterias. El estudio de la biología de una especie bacteriana, se ba- sa en la obtención de cultivos puros, de la especie sometida a estudio, recibiendo el nombre de cultivos puros aquellos me- dios que se encuentran infectados por una sola variedad de bac- teria. El material sometido al estudio muchas veces, por causas que no hemos podido evitar, se infecta de otras variedades de bacterias que por el momento no nos interesan, de ahí que na- ciera en Bacteriología la necesidad de introducir los aisla- mientos. Ante todo, siempre que se quiera practicar un aislamiento es necesario distinguir las bacterias aerobias de las anaerobias estrictas, y según que nos propongamos separar bacterias de este o aquel grupo, habrá o no necesidad de colocar los culti- vos en presencia o al abrigo del aire. En los cultivos hechos fue- ra del contacto del aire aislanse los microorganismos anaerobios. Ahora nos ocuparemos de los métodos de aislamiento de los 53 Técnica Bacteriológica aerobios. Los métodos de aislamiento son: 1. Alta dilución, también se llama, dilución en líquido*. 2. Aislamiento en medios sólidos. 3. Aislamiento a su temperatura óptima. 4. Aislamiento por inoculación. 5. Aislamiento por medios especiales. Tos dos primeros procedimientos, son mecánicos, los otros, son biológicos, es decir que necesitan de determinadas propie- dades de las bacterias para poder ser útiles. Por lo tanto los procedimientos mecánicos pueden utilizarse para aislar cual- quier bacteria, por ej. todas las variedades existentes en un producto dado, mientras que los procedimientos biológicos no permiten más que aislar determinada bacteria, cuya presen- cia sospechemos en tal o cual medio. MÉTODO DE ALTA DILUCIÓN: También se llama de suspensión o dilución en líquidos. Este método es primitivo, fué ideado por Lister y llevado a la práctica por Naegeli y Miquel, hoy en día es poco emplea- do, porque es largo y trabajoso y trae consigo un gran gasto de medio de cultivo. Se toman una serie de tubos de ensayo, hasta quince o vein- te y con una aguja de platino se toma el material y se va sem- brando en ellos sucesivamente, sin hacer ninguna nueva toma de material, con la esperanza de que en ios últimos tubos que- den pocas variedades, pues sabemos que cuando con una toma hacemos varias siembras, el número de bacterias disminuye del primero al último. Luego de obtenido el tubo donde encontra- mos la especie bacteriana que queríamos aislar, tomamos de 54 Compendio de Bacteriología ella paira hacer siembras que naturalmente serán puras. Este método era de elección cuando no se conocían los medios de cultivos sólidos. Método de aislamiento en medios sólidos: Este es el método que más se emplea en todos los Laboratorios. Su fundamento es- triba en la propiedad que tienen la gelatina y el agar de solidi- ficarse al enfriarse, circunstancia que se aprovecha, para que des- pués de sembrarse en estado líquido, se diseminen las colonias cuando estos dos medios toman el estado sólido. Este método consiste en lo siguiente: tenemos un tubo de ensayo con medio de cultivo, donde se encuentra, además del germen que queremos estudiar, muchos otros que no nos inte- resan. Tomamos cuatro o cinco tubos con agar e igual número de platillos de Petri. Ponemos los tubos de agar a fundir a ba- ño-maría, que tendrá que ser a la temperatura de ebullición y más tarde mantenemos, graduando la llama del mechero, una temperatura de 45° próximamente, temperatura a la cual el agar, se mantendrá fundido. Entonces tomamos con la aguja recta de platino una pequeña cantidad de colonias y las vamos sembrando en los tubos de agar. Estas siembras tendrán que ser por picadura y las haremos sucesivamente sin volver a to- mar otra muestra. Estos tubos serán marcados, 1, 2, 3, etc. se- gún el orden en que han sido sembrados de la misma manera que los platillos de Petri. Entonces, se verterán los tubos de agar en los platillos de Petri correspondientes, teniendo cuida- do que este agar fundido no se vierta al exterior. Además de las marcas 1, 2, 3, etc., se pondrá sobre los platillos, el nombre del germen que se pretende aislar y la fecha del aislamiento, siendo Levados entonces a la estufa, donde se mantendrá la temperatura óptima correspondiente a nuestro germen. Las ce- 55 Técnica Bacteriológica lonias irán diminuyendo en abundancia desde el platillo Io has- ta el 5o y en este, después del examen microscópico de las dis- tintas colonias que en él se encuentren, se podrá sembrar de la colonia que corresponda con el germen objeto de nuestro es- tudio. Método de aislamiento por temperatura óptima: Consiste en conocer previamente la temperatura óptima de la bacteria que vamos a aislar. Las temperaturas que se emplean son,las al- tas, las bajas y las que son disgenésicas para casi todas las de- más especies, menos la que vamos a aislar. Naturalmente, debemos pensar que no todas las bacterias pueden ser aisladas por este método, pues la mayoría de ellas no resisten ni bajas ni altas temperaturas, pero es precisamen- te que aprovechamos esta circunstancia, para separar de és- tas, aquellas que si pueden resistir o una baja o una alta tem- peratura. En cuando a las altas temperaturas tenemos que son solamente aquellas bacterias que producen esporos,' las que po- drán ser aisladas y muy pocas de otras especies que pueden re- sistir estas temperaturas. Un ejemplo de esto lo tenemos con los esporos del bacilo mesentericus, que pueden resistir temperatu- ras hasta de 130° sin morir, pues teniendo nosotros, un cultivo de esta clase de bacterias, pero infectados con otras de las cua- les la queremos separar, haremos una esterilización correspon- diente a la temperatura máxima de esa bacteria y obtendremos así un cultivo puro de esa clase de bacteria. La mayoría de los anaerobios se reproducen mediante espo- ros, muy resistentes al calor, por eso en ellos es donde tiene más aplicación este método. Pasteur lo empleó para el Vi- brión Séptico y Kitasato para el bacilo de Nicolaier. Suponga- 56 Cotnpendio de Bacteriología mos que queremos obtener un cultivo puro de bacilos tetánicos, pues haremos una herida a un curiel y la ensuciaremos con tie- rra, reconocida como tetanígena, si existen allí bacilos tetánicos, la herida se infectará de él, aunque también se infectará de otros gérmanes especialmente aquellos con los que el bacilo te tánico hace asociación microbiana, y tendremos que separarlos, pues entonces tomamos serosidad o pus del punto inoculado y lo llevaremos a 80° C. durante una hora o 100° C. durante 10 minutos y haremos una siembra de anaerobios. S. Arloing aisló el Pneumobacilo-liquefaciens bovis, some- tiendo los cultivos que lo contenían, a una temperatura de 5o C. temperatura que el podía resistir. Miquel aisló el bacilo urae de una orina en estado de pu- trefacción sometiéndola durante 2 horas a 80° C. Como dijimos al principio estos métodos no nos sirven como al- gunos de los otros para toda clase de aislamientos, sino que se trata únicamente de algunas especies de bacterias. Es muy uti- lizado sobre todo en el aislamiento de los anaerobios. Método de aislamiento por inoculación a un animal: Se funda en la inoculación de un germen patógeno, a un animal que sea muy susceptible a él, de manera que al producirse en él la enfermedad poder obtener de sus lesiones, sangre, etc. muestras puras de la bacteria que nosotros queremos estudiar. Las otras bacterias que al mismo tiempo tienen que ser inocu- ladas con la que nosotros queremos aislar, no se desarrollaran tan rápidamente y probablemente no se encontrará en las le- siones específicas, producidas por la otra bacteria. Un caso de esta naturaleza lo tenemos en el bacilo del muer- mo. Poseemos por ejemplo un cultivo de muermo, que ha sido 57 Técnica Bacteriológica infectado con otra especie cualquiera, entonces tomamos un co- nejillo de indias y le inoculamos ese cultivo, en ese animal se presentará antes que nada, la infección muermosa, esto no quie- re decir que más tarde, la otra bacteria que infecta el medio, si es patógena, también se manifestará, pero las primeras lesiones que presentará el euriel serán muermosa y la más característica, es la vaginalitis. En ese exudado de la vaginalitis, encontrare- mos abundantes colonias de bacilo de muermo, que podemos sembrar y de esta manera, obtendremos un cultivo puro de muermo. Puede usarse este método también para el bacilo tubercu loso, diftérico, etc. Existen muchos otros ejemplos de aislamiento por este método; no podemos enumerarlos todos, pero lo que se debe te- ner en cuenta en él es que un animal muy susceptible a una es- pecie cualquiera de bacterias servará para su aislamiento. Método de aislamiento por cultivos especiales: Practican- do la siembra en un medio de conveniencia especial para el ger- men objeto del aislamiento, se consigue el desarrollo de dicho organismo con exclusión de los demás que le acompañan. Sería el ideal de la Bacteriología Moderna el poseer un medio de cul- tivo para el aislamiento de cada especie bacteriana, esto es ideal e imposible de llevar a la práctica. Uno de los medios especiales más usados es el Suero de Loeffler, que se emplea para el aislamiento del bacilo diftéri- co. Sembrado el bacilo diftérico en él junto con otros gérmenes y llevado a la estufa, veremos que a los 12 o 14 horas se verán perfectamente bien las colonias del bacilo y examinadas al mi- croscopio, se verá que está completamente puro, pues los otros 58 Compendio de Bacteriología gérmenes que allí se colocaron no habrán germinado. Para la investigación del vibrión del cólera, recomiendan Koeh y Metchnikoff, medios especiales, poco nutritivos, pero que convienen perfectamente para el desarrollo del vibrión. Siémbrese, por ejemplo, un poco de la materia riziforme, en tu- bo de peptogeno-sal de Metchnikoff y coloqúese en la estufa a 38° C.: el vibrión se desarrollará muy pronto, mientras que las otras bacterias que le acompañan lo hacen con más lentitud. Además, como el vibrión colérico es muy aerobio forma un ve- lo en la superficie del líquido y basta cojer con un asa, a las 12 horas de la siembra, un poco del velo para cerciorarse de que existe allí un cultivo puro de vibriones. Otro medio de cultivo especial es el empleado para el ba- cilo de la Fiebre Tifoidea, que es mezclando 90 ele. de bilis de buey, con 10 ce. de gelatina y 2 gramos de pepsina, se distribu- yen en frascos de 20 cc, se esterilizan y se siembran en cada uno 3 cc de sangre, después de incubados, se siembra el con- tenido de cada frasco, sobre una placa de agar lactosado tor- nasolado. Existen muchos otros medios de cultivos especiales. 59 LECCION VIII. Conteo de Bacterias. Conocer el número aproximado de bacterias, que se en- cuentran infectando un medio cualquiera, ha sido siempre un asunto de mucha importancia para el higienista. No es posible, en un compendio como el presente, pretender describir detalla- damente todo lo que a esto se refiere, se dará por lo tanto una idea del asunto. (Véase Análisis Bacteriológico del Agua). Se hace muy dificil, en una pequeña cantidad de líquido contar el número de bacterias que contiene. Aún en las más pe- queñas cantidades existen miles de estos organismos, lo que im- plicaría una cuenta muy larga. Lo que se hace en estos casos, es diluir el material objeto del conteo y después, teniendo en cuenta esta dilución, hacer el cálculo. Existen muchos métodos especiales para contar bacterias. El método más usado, es sim- ple. Se toma una cantidad dada, del líquido que las contiene y de un tubo a otro tubo vamos haciendo diluciones, de la misma 61 Técnica Bacteriológica manera que hicimos para el aislamiento en medios líquidos. Te- nemos preparado un platillo de Petri, con medio nutritivo soli- dificado. Tomamos una cantidad de cualquiera de los tubos y apuntamos el tipo de dilución a que se encontraba el líquido en esc tubo. Esta muestra tomada, se coloca sobre el medio de cul- tivo en el platillo de Petri y se mueve este de manera que se deslice por toda su supeficie. Se llevará este platillo a un lugar obscuro, etc. propio para la germinación bacteriana. Al germi- rar, como habíamos hecho una dilución, aparecerán pocas colo- nias, las que podremos contar perfectamente, del modo siguiente: Existen para esto en el Laboratorio, unas placas de cris- tal, de tamaño mayor que una placa de Petri, que traen un cua- dro, perfectamente cuadriculado. Colocando este cristal sobre la placa de Petri, podremos contar el número de colonias que co- rresponden por cada cuadradito, igual que se hace para1 el conten de glóbulos rojos. Cuando las colonias son blancas, se emplea una película de cristal que hace el fondo obscuro, cuando son decromógenos se usa una que lo hace blanco. Entonces este resultado se multiplica por el tipo de dilu- ción usado al hacer la siembra y el resultado nos dará el núme- ro de bacterias (colonias) contenidas en esa cantidad de líqui- do, es decir la que se tomó para sembrar. Las aguas que corren por la superficie de la tierra, tienen gran cantidad de bacterias de distintas especies. El agua de Vento, es una de las que menos bacterias contiene. Para medir las bacterias que se encuentran en el aire, sé emplea generalmente un tubo, en el cual se coloca una sustan- cia que retenga los microorganismos que en el se encuentran, de ahí se parte por siembra para el conteo. 62 Compendio de Bacteriología Son muchos los aparatos que se conocen para efectuar es- ta operación, entre ellos tenemos el tubo de Miquel, el aparato de Frankland, el de Petri, etc. 63 LECCION IX. El microscopio y sus accesorios Las investigaciones bacteriológicas exigen el empleo de un buen microscopio, que proporcione aumentos de 600 a 1.200 diámetros. En la práctica corriente este aumento es suficiente, sin embargo pueden obtenerse mayores aumentos, hasta 3.000 diá- metros. Existen algunos gérmenes que a causa de su pequeñez extraordinaria, no pueden ser vistos ni por los más potentes mi- croscopios. Organismos que tengan 1 décima de miera de tama- ño, no se pueden ver, para ellos es necesario el uso del ultra- microscopio. La armadura, soporte o montura del microscopio, debe ser pesada y estable. El tubo del microscopio debe estar conectado con una cremallera, para movimientos rápidos y un tomillo mi- crométrico para los lentes. En la parte inferior del tubo, lleva un revolver para dos o tres objetivos. La platina debe ser de ebonita y si es posible, giratoria. El soporte debe llevar un apa- rato de iluminación que consistirá en un espejo, plano por un 65 Técnica Bacteriológica lado y cóncavo por el otro, un condensador de Abbé y un dia- fragma iris. Las investigaciones coirientes requieren el uso de dos ocu- lares y tres objetivos, entre estos últimos, uno seco 3. de menor aumento, otro seco de mayor aumento, 7 y uno de inmersión homogénea, 1:12. Condiciones de un buen objetivo: Primero: Poder ampli- ficante. Por aumento de un sistema óptico se entiende, la rela- ción existente entre la magnitud absoluta de la imagen y la del objeto, magnitudes que se refieren a una sola dimensión, la li- neal y que se representa en diámetros. Los fabricantes de mi- croscopios, acompañan siempre con cada aparato, una tabla donde figuran los aumentos que se alcanzan con las distintas combinaciones de oculares y objetivos. Segundo: Corrección de la aberración de refringencia. Pa- ra evitar Ja descomposición de la luz blanca, por las lentes del objetivo construyase cada una de éstas con dos vidrios, uno plauo-concavo y otro convexo. La lente convergente dispersa poco y la divergente, dispersa mucho: ambas deben tener un espesor conveniente para corregir esta aberración y se conocen con el nombre de lentes acromáticas. No es posible abolir esta aberración, de una manera completa, pues siempre se ven los objetos bien con sus contornos azulados o amarillos. Existen les objetivos apocromáticos, que tienen un acromatismo complero, pero para las prácticas corrientes, nos basta con las lentes acro- máticas en que esta aberración sea mínima. Tercero: Claridad. La claridad depende de la corrección de las aberraciones y de la abertura numérica: todo buen ob- jetivo debe abarcar un gran campo, blanco y uniformemente 66 Compendio de Bacterio logia iluminado. Cuarto: Distancia focal. El ángulo de abertura no puede ser grande más que cuando el objetivo tenga un foco muy cor- to. Los objetivos de gran aumento poseen necesariamente una distancia focal bastante corta (dos milímetros próximamente para los objetivos 7 y 1:12) ; pero no debe serlo tanto que cuan- do esté enfocado esté tocando al cubre-objetos; si existe este de- fecto, debe rechazarse el objetivo, pues no podrían observarse las preparaciones cubiertas con los cubre objetos ordinarias. Quinto: Poder de resolución. El poder de resolución de un objetivo hace que se observen con mayor detalle los rasgos más delicados de los objetos; esta es una condición que precisa la reunan en alto grado, los objetivos usados en Bacteriología, MANEJO DEL MICROSCOPIO Para hacer las observaciones, coloqúese el microscopio so- bre una mesa estable y resistente, instalada frente a una ventana y utilícese la luz clara del cielo o la proyectada por un mure blanco, pero nunca la de los rayos directos del sol. A falta de la luz natural, puede emplearse la iluminación artificial proce- dente de una lámpara de petróleo con corriente de aire o la de una lámpara eléctrica, y mejor la de un foco luminoso de gas (lámpara de Ranvier, por ejemplo) de altura variable y provis- to de mechero Aüer, pero interponiendo en este caso entre el foco luminoso y el microscopio una lámina de vidrio deslustra- do para disminuir la intensidad de la luz. La interposición de un matraz esférico de vidrio, lleno de agua, ligeramente teñida de azul por la disolución de sulfato 67 Técnica Bacteriológica de cobre amoniacal, permite obtener un excelente foco lumino- so. Es útil para proteger la vista del observador, la colocación de una pantalla delante del foco luminoso, de modo que solo sea alumbrado el espejo. ILUMINACION: Coloqúese el microscopio frente a la luz, cójase el espejo por sus costados e inclínese en varias direccio- nes, hasta que mirando por el ocular se vea el campo del mi- croscopio perfectamente alumbrado. Utilícese con los objetivos en seco, el espejo cóncavo que proyecta un haz de rayos convergentes sobre el sitio donde está colocado el objeto que se desea examinar. Cuando se emplee el objetivo de inmersión es necesario co- locar debajo de la platina, el condensador de Abbé, que, como transforma en un haz convergente los rayos paralelos que se reflejan en el espejo plano, produce una iluminación conside- rable. Siempre que se emplee el condensador es necesario uti- lizar el espejo plano. Coloqúese un diafragma bajo la platina, elegido con rela- ción al aumento que se emplee; es decir, de tanto más pequeña abertura cuanto mayor sea el aumento del objetivo, pues con el diafragma se corrigen las aberraciones de esfericidad y resul- tan las imágenes más claras, por interceptarse el paso de los ra- yos marginales, que son inútiles o perjudiciales. COLOCACION DEL OBJETO: El objeto debe colocarse sobre una lámina de vidrio muy transparente y muy limpia, lla- mada porta objetos y cubierta por otra lámina más fina todavía, que es el cubro-objetos. La preparación, entre estos dos crista- les, debe ser colocada sobre la platina, de manera que lo que se 68 Compendio de Bacteriología ha de ver, quede precisamente sobre el agujero redondo que esta tiene en su centro. OBJETIVOS DE INMERSION HOMOGENEA: El em- pleo de la inmersión tiene por objeto el oponerse a la desviación que experimentan los rayos luminosos cuando pasan del vidrio al aire. Praictícase uniendo la lente frontal del objetivo, con el cubre-objetos, por el intermedio de un líquido cuyo índice de refracción es idéntico o muy próximo al del vidrio (aceite de cedro, 1,515). Los objetivos de inmersión homogénea no nece- sitan corrección. El objeti' o de inmersión necesita emplearse con el conden- sador Abbé y no proporciona buenos resultados más que con una longitud determinada del tubo del microscopio (160 mms.) deposítese sobre el cubre una gota del aceite de cedro que acom- paña siempre el constructor con el microscopio y bájese el ob- jetivo hasta que su lente frontal se ponga en contacto con el lí- quido de inmersión. Debe reservarse el uso de este objetivo para hacer el estu- dio de preparaciones coloreadas; en cambio, no es muy aplica- ble al examen de los microorganismos sin coloración, porque la luz intensa que proporciona el condensador hace que las imá- genes de los objetos incoloros tenga sus contornos vagos y mal definidos. REVOLVER: El revólver más frecuentemente empleado es el construido para tres objetivos. Coloqúense en él. los nú- meros 3, de menor aumento, 7, de mayor aumento, estos dos secos y el 1 ¡12 de inmersión homogénea, teniendo cuidado de que estén bien atornillados, para conseguir un buen centrado: el movimiento de rotación del revólver, permite colocar sucesiva- 69 técnica Bacteriológica nitnté bajo el tubo clel microscopio, cada uno de los objetivos, sin necesidad de desatornillarlos. OCULARES: En la mayoría de los casos es necesario em- plear oculares de poco aumento, pues los de gran aumento am- plifican a expensas de la claridad y limpieza de la imagen: los números III y IV, solo se utilizan en ciertas investigaciones de- licadas, que exigen un aumento considerable; en cambio, los oculares I y II, son de uso corriente. Los oculares compensado- res tienen por objeto corregir las imperfecciones del acromatis- mo de los objetivos; solo se reservan para los aumentos más grandes. CONDENSADOR ABBE: El condensador de Abbé se com- pone de ti es láminas superpuestas, que son de arriba a abajo, una biconvexa, una cóncavo-convexa y una pk no-convexa. Es- tán montadas en una armadura metálica, cónica, y se encuen- tra situado, debajo de la platina, estando unido al soporte del microscopio, que permite echarlo hacia afuera, cuando no se vaya a usar. Este condensador, envía un cono de luz intenso, que hace que las partes, poco o nada coloreadas, desaparezcan por completo de la vista del observador. Este es el motivo por el cual algunos no lo utilizan en el examen de bacterias vivas (gota colgante). En nuestros microscopios puede hacerse este examen con el condensadoi puesto, utilizando para esto, el es- pejo plano. DIAFRAGMA IRIS: El diafragma iris está formado por una serie de láminas, unas fijas y otras movibles, montadas en un marco, que permite aumentar o disminuir la abertura cen- tral por medio de una palanca que tiene en su parte exterior. El diafragma se encuentra situado, entre el espejo y el con- 70 Compendio de Bacteriología densador y permito estrechar el campo del microscopio al mis- mo tiempo que graduar la cantidad de luz que necesitamos en el momento que estamos trabajando. MANERA DE ENFOCAR: Esta operación comprende dos tiempos: l.°, la determinación del foco aproximado y 2.®, el ha- llazgo del foco exacto. La distancia focal varía con los distintos objetivos, y es tanto menor, cuanto mayor es el aumento. Es preciso conocer, acostumbrarse a conocer aproximadamente la distancia focal de cada objetivo para efectuar rápidamente la primera operación ce enfocar. En nuestros microscopios, la distancia del objetivo seco de menor aumento, número 3, es de Vi de pulgada y la de los otros, es decir el seco de mayor aumento y el 1 i 12 de inmer- sión, alrededor de 1 milímetro. Este primer tiempo de colocar el objetivo a una distancia aproximada al foco, debe realizarse, por medio de los me ■imim- tos rápidos de la cremallera y mirando directamente al older o y al porta-objetos, NO DEBEMOS MIRAR POR EL OCULAR AL HACER ESTA OPERACION. Es preciso tener cuidado con esto, sobre todo cuando "+'~ lizamos objetivos de gran poder, oue tienen muy pcqr.e~a dis- tancia focal y en ese caso un descuido, nos hace romper la pre- paración, cosa que debemos evitar, no por la pérdida momentá- nea del trabajo que hayamos tenido al hacerla, ni la material del valor de ella, sino, porque con esto echamos a perder e1 oh- jetivo, pues las puntieas de los cristales al converger sobre ella lo rayan y con tres o cuatro de estos accidentes, podremos pc'- der nuestro objetivo, además que cuando estamos haciendo un examen de cultivo vivo, por ejemplo, de una bacteria que sea patógena, nos exponemos a infectar el Laboratorio. 71 Técnica Bacteriológica Una vez obtenida la distancia focal aproximada, entonces buscamos el foco exacto, con el tornillo micrométrico, el cual habremos tornillado previamente, de manera que todos los mo- vimientos que hagamos con él, serán hacia arriba y no habrá peligro de romper la preparación y a los pocos movimientos, ha- bremos encontrado el foco exacto. REGLAS A SEGUIR EN NUESTRO LABORATORIO: 1? SE TORNILLA EL MICROMETRICO, HASTA EL FIN, SIN APRETAR DEMASIADO. 2 ° SE APROXIMA EL OBJETIVO A LA PREPARA- CION, A SU DISTANCIA FOCAL APROXIMADA, MIRAN- DOLO DIRECTAMENTE. 3.° DESPUES DE ESTO, TRABAJAR SOLAMENTE CON EL MICROMETRICO NO CON LA CREMALLERA. CUIDADOS QUE HAY QUE TENER CON EL MICROS- COPIO : Debe conservarse el microscopio a una temperatura media, lejos de todo foco calorífico y al abrigo de los rayos di- rectos del sol, pues si la temperatura es demasiado elevada, fun- diría el Bálsamo del Canadá que une las lentes e inutilizaría para el uso, los objetivos. También es necesario proteger el mi- ercscopio del polvo atmosférico, colocándole en la mesa de tra- bajo sobro un trozo de fieltro grueso y tapado con una campa- na de vidrio. Deben practicarse las observaciones con las lentes suma- mentes limpias con un trozo de seda. Cuando se vea que existen residuos del polvo atmosférico en el campo del microscopio, se busca de la manera siguiente el sitio donde esté localizado: gírese el ocular sobre si mismo dentro del tubo y si las partículas de polvo se mueven con él, 72 Coir.p&ndio de Bacteriología será señal evidente de que están en el ocular; por el contrario, si permanecen dichas partículas inmóviles, es que están man- chando el objetivo. En estos casos determinados basta desmon- tar el sistema óptico y mirar la luz a través del ocular o el ob- jetivo para cerciorarse de la parte en que el polvo se encuentra alojado. Limpióse la lente frontal del objetivo frotándola suavemen- te mediante movimiento circular, con un lienzo muy limpio y muy fino; si fuese insuficiente esta limpieza se cortan dos tro- zos de médula de saúco que se aplican sobre la lente en el cen- tro de un corte reciente, imprimiendo entonces al objetivo un movimiento de rotación. Cuando la lente se haya ensuciado con aceite de cedro, bál- samo del Canadá o resina, se echa en un trozo de tela fina, una gota de xilol y se frota con él suavemente, pero teniendo la precaución de no mojar demasiado la lente ni verter el xilol sobre el objetivo, pues ese líquido penetrando entre la montura de lente, podría disolver el bálsamo que une las partes del vi- drio que la integra y estropear el sistema óptico. Cuando se exa- minen preparaciones en que haya reactivos químicos (potasa cansíica, ácidos, etc.), es necesario evitar que estos toques en las lentes, y si alguna vez ocurriera tal accidente, deben lavarse en- seguida. Si el objetivo continuara turbio a pasar de la limpieza de su lente exterior, no debe desmontarse para limpiar las interio- res, sino que se debe enviar al constructor, por ser el fínico que con conocimiento de causa, puede hacerla recobrar su estado primitivo. Es necesario evitar cuidadosamente el que los objetivos re- ciban golpes, caídas, etc., por insignificantes que sean. 73 Técnica Bacteriológica La limpieza del ocular y del condensador Abbé debe ha- cerse de igual forma que la del objetivo; sus lentes son más abordables y no son tan delicadas. De la misma manera se lim- piarán los espejos destinados a la iluminación. Después de cada observación, y antes de colocar el micros- copio debajo de la campana, deben limpiarse sus objetivos y oculares, sobre todo el de inmersión que ha de quedar exento del aceite de cedro. La parte correspondiente a la armadura, se limpiará con una piel de gamuza, frotando en el sentido en que se encuentre aplicado el barniz. Evítese manchar con bálsamo, aceite de ce- dro, etc.; pero si esto ocurriera, humedézcase la parte mancha- da con un trozo de tela ligeramente humedecida en xilol y fró- tese después con la piel de gamuza, teniendo siempre la precau- ción de no emplear un exceso de xilol, que no permanezca este mucho tiempo en contacto y no frotar demasiado, para evitar que se quite el barniz. La platina de ebonita debe limpiarse con un trozo de lienzo empapado en xilol; lubri tíquense de cuando en cuando con vaselina los tornillos y charnelas. 74 LECCION X Examen microscópico de bacterias vivas. El examen microscópico de las bacterias puede hacerse, es- tando éstas coloreadas o no. En esta lección trataremos sólo del examen de las bacterias vivas sin coloración. De esta clase de examen no podemos prescindir cuando estudiamos la biolo- gía de una especie bacteriana. Por medio de él, logramos cono- cer una serie de detalles, que no podríamos obtener de otra ma- nera, tales como los movimientos de las bacterias, germinación de esporos, esporulación, reacciones de aglutinación, etc., etc. La experiencia demuestra que este examen, al parecer de primera intención tan sencillo, no es así; en efecto, ofrece al- gunas dificultades al principiante. Por eso debe practicarse con mucho cuidado, siguiendo exactamente la técnica descrita más abajo. En algunos Laboratorios se acostumbra a hacer este exa- men, colocando la gota de líquido que se vá a estudiar entre un cubre y un porta-objetos ordinarios, pero esta es una mala prác- 75 Técnica Bacteriológica íica por lo menos en cuanto a trabajos de Bacteriología se refiere. Tiene dos inconvenientes principales, el primero es el de que la gota se seca rápidamente y no podemos hacer un examen de lar- ga duración y el segundo es el de que, la gota al encontrarse en- tre las dos superficies que la apricionan tiende a extenderse y puede salirse alguna cantidad, lo cual nos ofrece un gran peli- gro cuando trabajamos con un material infeccioso en ciertas condiciones de virulencia. Debemos preferir siempre el examen en gota colgante, con el cual evitamos estos dos inconvenientes. Gofa Colgante. En lugar del porta-objetos plano ordinario, usaremos uno que tiene una excavación circular en su centro. Se toma un cu- bre-objetos bien limpio y se colocará en el borde de la mesa en que estemos trabajando. Si la bacteria que queremos examinar se encuentra en un medio líquido, no tendremos más que tomar del tubo una gota, con el asa de platino previamente esteriliza- da y colocarla sobre el cubre-objetos. Si procede de un medio sólido u otro lugar, entonces tenemos que hacer una dilución. Consiste esto, en colocar previamente sobre el cubre-objetos una gota de caldo simple, agua o suero fisiológico y después tomar del medio sólido y tocar la gota con el asa de platino, de esta manera las bacterias quedarán suspendidas en la gota y las podremos estudiar de la misma manera que si procedieran de un medio líquido. Al hacer esta dilución, debemos siempre pre-, ferir el caldo simple sobre el agua y el suero, puesto que en es- tos líquidos, pueden las bacterias experimentar ciertas altera- ciones osmóticas que induzcan a errores. No debemos llevar 76 Compendio de Bacteriología gran cantidad de bacterias a la gota en este caso, sino simple- mente, como se ha dicho más arriba, tocar la gota. Obtendre- mos el mismo resultado examinando unos cuantos elementos, que miles de ellos. Preparado ya el cubre-objetos, con su gota en el centro, tomaremos el porta y untaremos de vaselina todo el contorno de la excavación. Entonces el porta-objeto con la excavación vuelta hacia abajo, se colocará sobre el cubre, de mane- ra que la gota quede en el centro. Oprimiéndolo ligeramen- te, quedarán perfectamente adheridos ambos cristales. Invir- tiendo con cuidado la preparación, estará lista de ser llevada a la platina del microscopio. De esta manera la gota se encontrará pendiente en una cámara herméticamente cerrada, formada por el cubre y la excavación, que la protegerá contra la desecación. Colocada la preparación en la platina, cerraremos casi com- pletamente el diafragma, colocaremos bajo el tubo del microsco pió,el ocular No. 3, de menor aumento y precederemos a buscar el borde de la gota. Este objetivo comoi ya sabemos, tiene una distancia focal de un cuarto de pulgada. Si al mirar nosotros por el ocular en estas condiciones no nos aparece el borde de la gota, entonces tomaremos la preparación o moveremos hacia to- dos lados los tornillos de la platina, si es movible, hasta que aparezca. Se verá una raya blanca, que al principio es difusa, pero que enseguida se aclara, precisando el foco con el micro- métrico. Colocaremos la gota en el centro del campo y de delan- te atras. Con este aumento no podremos apreciar las bacterias, entonces lo que hacemos es cambiar de objetivo. Se colocará ba- jo el tubo, el seco de mayor aumento. Como la distancia focal de este es pequeña, tenemos que tener cuidado cuando la acerca- mos al cubre-objetos y lo hacemos mirando directamente por la 77 Técnica Bacteriológica parte de afuera. Otra precaución que no debemos olvidar es la de que debemos cerrar completamente el micrométrico antes de colocar el objetivo a su distancia focal. Una vez colocado, trabajaremos exclusivamente con el mi- crométrico, de modo que todo movimiento que con él hagamos, será hacia arriba y nos será imposible romper la laminilla. El foco exacto aparecerá enseguida de esta manera. Debemos esco- jer para observar, el borde de la gota, que es donde conseguimos la visión más clara de los microorganismos y en caso de que sean anaerobias, las veremos agruparse allí. Terminado el examen, se desplaza el cubre-objetos, hasta que uno de sus ángulos sobresalga del borde del porta; se le- vanta con unas pinzas, teniendo cuidado de que la gota no man- che el porta-objetos y si es posible, ningún otro objeto y lo in- troduciremos en un recipiente que contenga sublimado o cual- quier otro desinfectante. De esta manera el porta nos servirá para otras investigaciones. 78 LECCION XI. Examen microscópico de las bacterias coloreadas. La coloración de las bacterias es la base de su estudio al microscopio. Ella nos permite verlas mejor, conocer los detalles de su estructura, ver los esporos, flagelos, etc., estudiarlas en los tejidos, conocer ciertas propiedades de su protoplasma en cuanto a la coloración (método de Gram, doble coloración de ácido-resistentes), que nos hace llegar más rápidamente a su diagnóstico. Para teñir las bacterias se emplean principalmente los co- lores básicos de la anilina (fuchsina azul de metileno, violeta de genciana, safranina, etc.) derivados de la rosanilina y que por el carácter básico de ésta, reciben el nombre de colorantes básicos. La coloración no resulta de impregnar la bacteria con la materia colorante; representa más bien una combinación en- tre el colorante y el protoplasma de éstas; es decir una reac- 79 Técnica Bacteriológica ción microquímica, por esto es que a las fórmulas de todos los colorantes usados en Laboratorio, se le añade una sustancia que recibe el nombre de mordiente, que tiene por función, fijar esta materia colorante al protoplasma bacteriano. Entre los principales mordientes que usamos en Bacteriología, tenemos, el ácido fénico, el alumbre, el agua de anilina, la potasa caus- tica, etc. Para llegar a la obtención de una preparación coloreada, tenemos que seguir una serie de manipulaciones que será nece- sario ejecutar en todos los casos, con ligeras variaciones según la clase de coloración que vayamos a hacer. Son éstas, exten sión del material, desecación, fijación, coloración, lavado y montaje. Extensión del material: El material puede extenderse, en el porta o en el cubre-objetos, en el primer caso pueden obte- nerse buenas preparaciones, pero no nos será posible conservar- la mucho tiempo; en el segundo caso obtenemos mejores prepa- raciones y permanecerán conservadas por mucho tiempo, es por lo tanto preferible extender el material sobre un cubre-objetos El hacer una buena extencióz? nos garantiza casi una buena pre- paración al final. Debemos tender a que el material que va a ser coloreado, forme una ligera película sobre el cristal en que se encuentra y esto es fácil de obtener, cuando el medio de cultivo o en general el material que vayamos a examinar sea líquido. Cuando tomamos de un medio sólido o un material cualquiera de esta consistencia, debemos hacer una dilución, es decir colo- car una gota de un lí quido cualquiera sobre el cubre-objetos y después tomar el material con la aguja de platino y extenderlo bien, de manera que no queden grumos, los cuales serán lugares 80 Compendio de Bacteriología (le la preparación donde no se podrá precisar detalle alguno, que son los importantes en estos casos. DESECACION: Después de extendido el material tenemos secarlo; esto se hará, colocándolo al calor que despide la llama ma del mechero Bunsen. Para esto tomamos la pinza de Cornet, donde tendremos puesto el cubre-objetos y colocando nuestro de- do índice cerca de la preparación la colocaremos a cierta dis- tancia del mechero. La desecación es necesaria para proceder inmediatamente a efectuar la fijación. FIJACION: Este tiempo es muy importante y tiene por objeto el que las bacterias no se desprendan del cristal, duran- te los lavados a que tiene que ser sometida más tarde. Esto se verifica pasando el cubre-objetos, tres veces por la llama no iluminante del mechero. También puede hacerse colocando so- bre el material extendido y seco, unas gotas de alcohol absoluto o alcohol-éter y dejándolo secar sobre ella. En nuestro Labora- torio usamos el primer método que es rápido y bueno. COLORACION: Se verterá sobre el cubre-objetos una can- tidad suficiente de la materia colorante que usemos, de manera que lo cubra completamente. En cuanto al tiempo que se debe dejar actuando, es variable según el poder colorante de la so- lución que usemos. Fluctúa alrededor de 5 minutos. LAVADO: El lavado debe hacerse enérgicamente; es decir, colocando el frasco lavador a cierta altura de la preparación de manera que el chorro de agua aclare todo lo posible el campo. Muchas veces esta clarificación del material coloreado tiene que ser más enérgica y en ese caso se usará el alcohol, lavando des- pués con agua. 81 Técnica Bacteriológica MONTAJE: Después de lavada, dejaremos secar la pre- paración y colocando una gota de bálsamo de Canadá en el por- ta-objetos, colocamos sobre el, el cubre, con el lado colo- reado de la preparación,- mirando hacia la gota. Para que la gota de bálsamo se extienda bien entre ambas láminas, hacemos una lijera presión sobre la laminilla. De esta manera, quedará lista la preparación para ser llevada al microscopio. Puesta sobre la platina del microscopio, colocaremos sobre ella, una gota de aceite de cedro y pondremos a enfocar, el ob- jetivo 1:12 (Leitz, Westlar) de inmersión. Usaremos el con- densador de Abbé, el espejo plano y abriremos completamente el diafragma, pues en estos casos necesitamos gran cantidad de luz en el campo del microscopio. COLORACION SIMPLE POR CARBOL-FUCI1SINA A continuación pondremos dos ejemplos de coloración sim- ple, una por medio del colorante Carbol-fuchsina y otro por el Azul alcalino de Loeffler. Primer tiempo-: Se extiende el material. Segundo tiempo: Se seca, al calor de la llama. Tercer tiempo: Se fija, pasando tres veces por la llama. Cuarto tiempo: Se colorea, durante cinco minutos en calien- te c on: Carbol-fuchsina o Fuchsina fenicada de Ziehl. cuya fórmula es: Fuchsina 1 gramo. Acido fénico (rediente) 5 gramos. Alcohol absoluto 10 ce. 82 Compendio de Bacteriología Agua destilada 100 cc. Quinto tiempo: Se lava con alcohol. Sexto tiempo: Se lava con agua. Séptimo tiempo: Se monta sobre bálsamo Canadá. COLORACION SIMPLE POR AZUL DE LOEFFLER Primer tiempo: Se extiende el material. Segundo tiempo: Se seca al calor de la llama. Tercer tiempo: Se fija pasándose tres veces por la llama. Cuarto tiempo: Se colorea por 10 minutos en frío con Azul alcalino de Loeffler. cuya fórmula es: Solución alcohólica saturada de Azul de metileno. . 30 cc. Solución de Potasa caustica al 1 por 10,000 (mordiente) 100 ce. Quinto tiempo: Se lava con agua. Sexto tiempo: Se monta sobre bálsamo. 83 LECCION XII. Métodos especiales de coloración. COLORACION DE BACILOS ACIDO-RESISTENTES: Existen un grupo de bacilos que se conducen de manera pecu- liar en cuanto a la coloración, este es el grupo de los bacilos ácido-resistentes, cuyo nombre se les ha aplicado, por la dificul- tad que presentan a su decoloración, después que han tomado un colorante, aunque las sustancias que se empleen para deco- lorarlas sean de actuación enérgica en cuanto a. esta propiedad. Se puede hacer de esta manera con ellos, lo que se llama colo- ración de contraste, es decir, colorear primero la preparación, decolorar y después colorearla con otro color, de manera que estas bacterias aparecerán con el color primitivo (rojo, por ejem- plo) y las demás que con ellas se encuentren, que se decolora- rán, apa reverán con el segundo color (azul). Recibe el nombre este procedimiento de doble coloración, porque se emplean dos colorantes en ella. Se emplea con un valor práctico de diagnós- tico extraordinario, para los bacilos de Koch y Hansen, de la tuberculosis y la lepra respectivamente. En las preparaciones teñidas por este procedimiento aparecerán los bacilos antes men- 84 Compendio de Bacteriología cionados, coloreados en rojo (por la fuchsina de Ziehl) y los demás elementos que en ella se encuentran, en azul (por el azul de Loeffler). He aquí la técnica: Primer tiempo: Extender el material. Segundo tiempo: Se seca. Tercer tiempo: Se fija (3 pases a la llama). Cuarto tiempo: Se colorea, con carbol-fuchsina, 5 minutos en caliente. Quinto tiempo: Decolorar, lavando la preparación con una so- lución de ácido clorhídrico al 3% o ácido nítrico o sulfúrico al 25% en alcohol. Sexto tiempo: Lavar con alcohol. Séptimo tiempo: Lavar con agua. Octavo tiempo: Colorear con azul de Loeffler, 10 minutos en frío. Noveno tiempo: Lavar con agua. Décimo tiempo: Secar la preparación. Onceno tiempo: Montar sobre bálsamo de Canadá. Se conoce este procedimiento de coloración, también con el nombre de ZiehLNielsen, y como se ha dicho antes, es univer- salmente utilizado para el diagnóstico de la tuberculosis y la lepra. COLORACION DE ESPOROS: La coloración de esporos se funda en el mismo principio que acabamos de explicar para los bacilos ácido-resistentes. Solo existe una variante y es que como la cubierta de estos es tan fuerte, necesitamos valernos de medios especialmente enérgicos para que puedan tomar el primer colorante. Terminada la primera coloración, será muy difícil despojar a los esporos de su color, no así a las formas 85 Técnica Bacteriológica vegetativas (pie se encuentran en la misma preparación, de ma- nera que éstas tomaran el segundo colorante y veremos en la misma preparación, los esporos teñidos en rojo y las bacterias en azul. Las variaciones que tiene este método sobre el anterior, es- tán en los tiempos tercero y cuarto. En el tercer tiempo, en vez de pasar el cubre-objetos tres veces por la llama, lo pasaremos doce veces, con objeto de disminuir la resistencia de la pared del esporo y en el cuarto tiempo, verteremos INMEDIATA- MENTE después del último pase por la llama el colorante so- bre el cubre objeto de manera que estos se tiñan mejor. Todos los demás tiempos serán exactamente iguales. COLORACION DOBLE DE ESPOROS Primer tiempo: Se extiende el material. Segundo tiempo: Se seca. Tercer tiempo: Se fija pasándose doce veces por la llama INMEDIATAMENTE. Cuarto tiempo: Carbol Fuehsina, 5 minutos al calor. Quinto tiempo: Se decolora con HC1 al 3% en alcoliol. Sexto tiempo: Se lava con alcohol. Séptimo tiempo: Se lava con agua. Octavo tiempo: Azul Loeffler, 10 minutos en frío. Noveno tiempo: Se lava con agua. Décimo tiempo: Se seca y se monta en bálsamo de Canadá. COLORACION POR EL METODO DE GRAM: Este es un procedimiento de coloración electivo. Es una doble colora- ción, en la cual unas bacterias toman un color u otro según su particular resistencia a la decoloración por la solución de Gram 86 Compendio de Bacteriología (solución yodo-yodurada), de esta manera siendo tratadas por este método es posible clasificar las bacterias en dos grupos. Los colorantes que utilizamos en ella son en primer lugar la anilina violeta de genciana y en segundo, un colorante de contraste que puede ser la fenicada diluida o Zichl diluido. Después de ser tratadas las bacterias por el primer colorante, violeta de gen- ciana, todas lo toman, son lavadas con la solución yodo-yodu- rada de Gram, en este caso algunas lo ceden y otras no, de esta manera al ser tratadas por el segundo colorante, las que se de- coloraron, lo tomaran. Según queden o no coloreadas las bacte- rias serán llamadas, en el primer caso GRAM-POSITIVAS, en el segundo, GRAM-NEG AT1VAS. Las GRAM-POSITIVAS; por lo tanto aparecerán coloreadas en violeta y las GRAM-NE- G ATICAS, coloreadas con el color de contraste, en este caso, el rojo. Se usan también los términos de RESISTE AL GRAM y NO RESISTE AL GRAM, TOMA y NO TOMA EL GRAM, pero no deben usarse, pues tienden a confundir sobre todo a les principiantes. He aquí la técnica: Primer tiempo: Se extiende. Segundo tiempo: Se seca. Tercer tiempo: Se fija, pasando tres veces por la llama. Cuarto tiempo: Se colorea, con anilina violeta de genciana, cuya fórmula es: Agua destilada 100 cc. Aceite de anilina 5 cc. se mezcla y se filtra, y se le agrega: Unas gotas de solución alcohólica saturada de violeta de genciana. El agua de anilina actúa en este caso de mordiente. Este colorante es muy inestable, de manera que deberá prepa- 87 Técnica Bacteriológica rarse siempre momentos antes de hacer la coloración. Este colorante debe dejarse actuar, por 5 minutos, en ca- liente. Quinto tiempo: Se lava con el decolorante, solución de Gram, cuya fórmula es: Yodo 1 gramo. Yoduro de Potasio 2 gramos^. Agua destilada 300 ce. Sexto tiempo: Se lava con alcohol. Séptimo tiempo: Se lava con agua. Octavo tiempo: Se aplica el segundo colorante, Ziehl diluido: Fuchsina fenicada Ziehl 1 cc. Agua destilada 10 cc. Noveno tiempo: Se lava con agua. Décimo tiempo: Se seca. Onceno tiempo: Se monta sobre bálsamo. Daremos a continuación un grupo de bacterias muy impor- tante, unas que pertenecen a un grupo y otras que pertenecen al otro grupo: 88 Compendio de Bacteriolcgia GRAM POSITIVAS Estafilococos. Estreptococos. Neumococos. Sareinas. Carbunclo. B. Subtilis. B. Mesentericus. B. de la Difteria. B. de Koch. B. de la Lepra. GRAM NEGATIVAS Gonococo. Meningococo. Micrococo catarralls. Micrococo Melitensis. Colibacilo. Bacilos Tífico y Paratífico A y B. B. Disentéricos. B. de la Peste. B. del Muermo. Vibrión Colérico. B. Piociánico. B. de Friedlander. Será pues, su actuación frente al Gram un detalle más que podremos obtener, cuando tratamos de hacer el diagnóstico de una especie microbiana. 89 LECCION XIII. Bacilos Mallei o del Muermo. Fue descubierto en 1882 por Loeffler y Schütz. Produce una enfermedad particular de los équidos, pero que puede trans- mitirse al hombre, de ahí su importancia, tanto en Medicina Veterinaria, como en la Humana. Se le encuentra abundantemente, en las fosas nasales de los animales que padecen de muermo y en las lesiones cutáneas, en los lamparones. Estas dos son las formas clínicas que pre- senta esta enfermedad. Es de una gravedad extremada, y tie- ne una gran mortalidad. ASPECTO MICROSCOPICO: Es un bacilo pequeño de ex- tremidades redondeadas, tiene de 3 a 5 miera de largo, que pre- senta distintos aspectos según el lugar de donde proceda. En los cultivos, caldo glicerinado, patata, tiende a disminuir de ta- maño y a la formación de caderias (estreptobacilos). En los cultivos viejos, presenta distintas formas de involución, filamen- 91 Técnica Bacteriológica tosas, ramificadas y algunas veces tienen hasta el aspecto de mi- crococos. Es procedente de las lesiones muerniosas que se ob- tienen de él, los aspectos más característicos. No tiene movi- miento propio. TINCION: No tiene coloración específica. Se tiñe corrien- temente, por los colores básicos de la anilina, ej. el Azul de Loe- ffler. Estas preparaciones presentan al bacilo con un aspecto granuloso, pues su protoplasma se tiñe irregularmente por el colorante. Estos espacios claros que el bacilo presenta a su in- terior dieron lugar a que se pensara que producía esporos. Se ha demostrado que esto no es así. Coloreado por el método de Gram aparece teñido en rojo, es decir, es GRAM NEGATIVO. Estos son los detalles que las coloraciones aportan para su diag- nóstico. BIOLOGIA: Es aerobio estricto y no produce esporos. Es muy difícil de cultivar, perdiendo al poco tiempo de sembrado, su virulencia y más tarde pereciendo. Su temperatura óptima se encuentra de 35 a 38° C. Se detiene su desarrollo a menos de 22° C. y a más de 42° C. Mueren por la acción de una tem- peratura de 55 a 60° C. en pocos minutos. Es muy susceptible a todos los antisépticos. Es muy frágil a la desecación. Prefiere los medios de cultivo de reacción neutra o ligera- mente alcalina, estando en primer lugar, para su mejor desa- rrollo, la patata alcalinizada y el agar-glicerinado. En la pri- mera produce unas colonias salientes, espesas, brillantes y de color pardusco, que son características. No licúa la gelatina. Coagula la leche. Aun cultivado en sus medios de elección es tanta su fra- gilidad, que llegan a perecer sin que causa especial alguna ac- 92 Compendio de Bacteriología túe sobre ellos. Para aumentar la virulencia de los cultivos y no perderlos, debemos hacer la inoculación intraperitoneal en la pared abdominal del euriel, obteniendo del líquido de la vagi- nalitis (lesión característica de los bacilos muermosos en este animal) el material, rico en gérmenes virulentos, para hacer la resiembra. Debemos recordar en este caso que el euriel tiene que ser macho. DIAGNOSTICO: Encontramos el bacilo del muermo, en los productos patológicos (pus, secreción de chancros, lamparo- nes, etc.) del infectado. Tiende sobre todo a invadir el sistema linfático. Se le encuentra excepcionalmente en la sangre de los animales y seres humanos. De estos lugares que hemos dicho, tomaremos el material que habremos de examinar en el microscopio. Debe recordarse que la coloración preferente es la de azul de Loeffler. (Colora- ción simple). Algunas veces no encontramos el bacilo dé este modo y en- tonces, tenemos que hacer siembras, naturalmente, en los medios de cultivo de su elección e inoculaciones al conejillo de Indias. Esta inoculación, la hacemos debajo de Ja piel del cobayo, en cuyo lugar se formará un abceso muermoso característico, con tumefacción de los ganglios próximos, todos estos lugares de ben ser ricos en bacilos muermosos. Algunos días después el animal presenta la vaginalitis muermosa, que como hemos di- cho anteriormente es la lesión característica, adelgaza rápida- mente y muere en un lapso de treinta días. En el momento de su muerte, se encuentra accesos miliares en casi todos sus ór- ganos. REACCION DE LA MALLEINA: El diagnóstico precoz 93 Técnica Bacteriológica del muermo en el caballo se hace por medio de la reacción de la malleina (toxina producida por el bacilo del muermo). PREPARACION DE LA MALLEINA: Se toma un virus y se siembra en caldo glicerinado. Este cultivo, se deja durante un mes a la estufa a 37° C. y después se esteriliza a una tem- peratura de 100° C. durante 30 minutos. Se reduce el cultivo a l|10 de su volumen primitivo y se le añade de glicerina. Esta es la malleina bruta. Para emplearla, es mejor diluirla en una solución de agua íenicada al 5%. Por una parte de ma- lleina, nueve de agua fenicada. Téngase el caballo en observación, tomándosele la tempera- tura, porque no deben incluirse en esto los animales febriles e inyéctese subcutáneamente en el cuello, 2^ cc. de malleina diluida. En el animal infectado de muermo, se producirá: Una reacción local, edema doloroso, no supurante que du- rará unos días; y Una reacción general, caracterizada principalmente por un aumento considerable de la temperatura, abatimiento, temblores, etc. 94 LECCION XIV. Bacilo de Klebs-Loeffler o de la Difteria. Fue descubierto en 1883, por Klebs, quien le encontró en las membranas faríngeas de enfermos de difteria. Un año más tarde logró Loeffler obtener cultivos puros de él e identificarlo como productor de esta enfermedad. Se le encuentra en ias falsas membranas o en la mucosa faríngea de los enfermos, en los que persiste por algunas sema- nas después de la curación. En personas sanas que han estado en contacto con enfermos también se ha encontrado (portadores de gérmenes), las que seguramente son una fuente principal de propagación de la enfermedad. No invade la sangre, ni los ór- ganos internos. Solo se ha encontrado, en focos broncopneumó- nicos después de un a+aque de crup. Debemos saber que este bacilo actúa sobre el organismo, exclusivamente por su to- xina, como sucede con el bacilo tetánico, es decir ambos ocasio- nan una toxemia pura. ASPECTO MICROSCOPICO: Vistos en gota colgante, se 95 Técnica Bacteriológica presentan como bacilos rectos o ligeramente incurvados, que presentan unas granulaciones refringentes en sus polos. Su ta- maño es variable (pequeño, mediano y grande). Los más peque- ños tienen un micrón, los más grandes llegan a cinco miera. En los cultivos viejos se encuentran formas de involución, que ha- cen aparecer a los bacilos, con los extremos redondeados, en ma- za, granulosos y algunas veces con ramificaciones. TINCION: Se colorean muy bien por el Azul de Loeffler, apareciendo en los campos microscópicos, agrupaciones que tie- nen formas de V e Y, característicos. Raramente se les encuen- tran paralelos. En estas preparaciones aparecen los bacilos dé- bilmente teñidos en sus cuerpos, pero fuertemente en sus polos, estos son los gránalos metacromátieos de Babés, a cuya apari- ción, se le da gran importancia diagnóstica. Estos granulos tien- den a desaparecer en los cultivos viejos. Teñido por el método de Gram, aparece violeta, es decir, es GRAM POSITIVO. BIOLOGIA : Es un anaerobio discrecional y no produce es- poros. Su temperatura óptima se encuentra entre 35 y 37° C. Sin embargo puede crecer entre los límites de 20 y 42° C. En los cultivos, pueden conservarse vivos durante bastante tiempo. En los cultivos, en caldo, por ejemplo, es muy sensible a los agentes destructores, pereciendo a los pocos minutos a una tem- peratura de 58°. Procedentes de las membranas diftéricas y de- secados, presentan más resistencia al calor. La luz tiene sobre ellos una acción bastante enérgica. Son muy susceptibles a los antisépticos (Acido fénico al 5%, bicromato de Potasio al 2%) sobre todo en los cultivos. Los cultivos, naturalmente, van perdiendo su virulencia. Este puede restituírsele, cuando no han llegado a perderla por 96 Compendio de Bacteriología completo, por medio de inoculaciones a la cobaya, de bacilos con toxina o en asociación con estreptococos. (Roux y Yersin). Crece bien en caldo, en el cual, a una temperatura de 37° C., aparecen sus colonias de 12 a 24 horas. En agar-agar, su crecimiento es más tardía, sobre todo en primera siembra. En las resiembras, sobre todo en el mismo medio, va germinando cada vez más rápidamente. No coagula la leche ni fluidifica la gelatina. En estos dos medios, puede germinar. El medio de elección para su desarrollo es el suero de Loe- ffler, que ya ustedes conocen. En él, puesto a una temperatura de 37° C. se ven aparecer colonias a las 12 o 14 horas después de sembrado. El diagnóstico precoz bacteriológico de la difte-K ria se hace muy fácil por esta propiedad. Bastará tomar un tu- bo de suero de Loeffler dentro del cual se encuentra un hisopo, ambas cosas estériles. Tomando material de la garganta del en- fermo y haciendo una siembra por hisopo, veremos esa germi- nación abundante. Haciendo después coloraciones por el azul de Loeffler y el Gram, podremos comprobar el diagnóstico. Los demás gérmenes que se siembran junto con él, no germinan con la rapidez que el lo hace o no lo hacen, de manera, que por este procedimiento, podremos aislarlo. Existe la reacción de Schick, que sirve para conocer, si determinado individuo, posee o no anticuerpos diftéricos y con- siste en inocular en el dermis, una pequeñísima cantidad de to- xina diftérica (0.1 ce. corresponderá a una quincuagésima de la dosis mortal en cuatro días para una cobaya de 250 gramos de peso). A las 24 horas, dos cosas se observan; o se forma una au- reola que alcanza su máximo a las 48 horas, o no se presenta reacción alguna. En el primer caso, el individuo es receptivo a 97 Técnica Bacteriológica la difteria, en el segundo caso, no lo es, es decir, tiene suficiente cantidad de anticuerpos en su suero sanguíneo, que aseguran su inmunidad. Casi todos los animales son susceptibles a la acción de la toxina diftérica, con la excepción de la rata y el ratón, que lo son en muy pequeño grado. 98 LECCION XV. Bacilo de Koch o de la Tuberculosis. Fué descubierto por Roberto Koch, en el año de 1882, me- diante el empleo de procedimientos especiales de cultivo y colo- ración. Es innecesario señalar la importancia que tiene su estu- dio en Medicina, harto conocidos son los resultados de las in- fecciones en que el se encuentra. Casi todos los animales son sus- ceptibles a su acción. En el hombre, es en la forma pulmonar de la enfermedad, donde más corrientemente se le encuentra, sin embargo actúa de muy distintas maneras sobre el organismo hu- mano. Ha sido una de las bacterias mejor estudiadas en su bio- logía, debido al afán que siempre ha existido de librar a la hu- manidad de sus fatales ataques. ASPECTO MICROSCOPICO: Es un bastoncillo hialino, inmóvil, de 2 a 3 miera de largo, rectos o ligeramente incurva- dos y de extremidades redondeadas. A veces presenta vacuolas en su interior, que simulan esporos. Se pueden encontrar diver- sas formas de él, sobre todo ramificadas (Metchnikoff), que no 99 Técnica Bacteriológica son más que formas de involución. TINCION: Debido a su cubierta de sustancias grasas, toma con dificultad los colores básicos de la anilina, sin embargo una vez que los ha tomado, es muy difícil decolorarlos aún por los procedimientos más enérgicos (en esto se funda el método de coloración de Ziehl-Nielsen, para su diagnóstico) igual que le sucede a los esporos. (Véase, coloración de bacilos ácido-resis- tentes) . Es Gram-positivo, como casi todos los ácido-resistentes y en esta coloración como en la (Je Ziehl, presenta una forma gra- nular especial, que es otra forma de involución. Esta última forma es la que se encuentra en el esputo. BIOLOGIA: Es aerobio estricto y no forma esporos. Per- tenece al grupo de los bacilos ácido-alcohol-resistentcs, donde se encuentran también los bacilos de la lepra y del esmegma, por esa particular resistencia que presentan a la decoloración. Aun- que no forma esporos, el bacilo tuberculoso es mucho más resis- tente a los agentes destructores, que las otras bacterias no-espo- rulantes, debido esto probablemente a la envoltura grasosa que lo rodea. Conserva la vida durante meses aun cuando perma- nezca frente a influencias desfavorables, como la desecación, de ahí el peligro de permitir a los enfermos pulmonares, el escupir en el suelo. Después de seco el esputo, los bacilos que en él se encuentran, conservan la vida por algún tiempo. Resiste una temperatura de 65° C. durante 15 minutos y la de 85° C. duran- te 1 minuto. Un agente físico, al cual es muy susceptible, es la luz, sobre todo, los rayos directos del sol, frente a los cuales pe- recen alrededor de media hora. Los cultivos mueren en algunos días si se les somete durante estos, a la presencia de la luz di- 100 Compendio de Bacteriología fusa. De los antisépticos, el agua fenicada al 5%, tarda 24 ho- ras en destruirlo, el bicloruro de mercurio, también al 5% ne- cesita 2 horas. Su temperatura óptima se encuentra entre 37 y 38° C. Koch al cultivarlo por primera vez, utilizó suero coagu- lado. Crece bien, aunque tardíamente en todos los medios adi- cionados de 5% de glicerina (agar, suero, caldo, patata). Sus colonias tardan fhás de una semana en aparecer. Estos cultivos, al resguardo de la luz y a su temperatura óptima, viven duran- te largo tiempo. DIAGNOSTICO: En todo producto, esputo, por ejemplo, sospechoso de contener bacilos tuberculosos, debe hacerse la do- ble coloración. El bacilo de la tuberculosis no es solo patógeno para el hom- bre, también lo es para Jos animales; entre estos ocupa el pri- mer puesto, el conejillo de Indias. La inoculación subcutánea o intraperitoneal a este animal, nos permite el diagnóstico de su existencia, porque este muere infaliblemente, con una reacción característica siempre, según la inoculación (fue hayamos hecho. De esta manera, podemos también obtener el bacilo, en estado de pureza. En el cobayo, después de la inoculación subcutánea de un producto tuberculoso, vemos que en el sitio de la inoculación, se desarrolla un nodulo que tiene tendencia a reblandecerse, abriéndose más tarde al exterior. Este es el chancro tuberculo- so. Todo el sistema ganglionar vecino se inflama. El animal en- flaquece rápidamente y muere al cabo de algún tiempo, presen- tando granulaciones tuberculosas en todo su cuerpo, sobre todo en las serosas. En la inoculación intraperitoneal, el cuadro es 101 Técnica Bacteriológica parecido al anterior, pero mucho más rápido. El chancro tuber- culoso en este caso no se produce. En los casos incipientes de esta enfermedad, en que ningu- no de estos medios nos ha dado resultado, sirven para el diag- nóstico, las distintas reacciones que produce en el organismo, enfermo o sano, la toxina extraída de los bacilos, la tuberculi- na. La inyección de pequeñísimas cantidades (l|500 de miligra- mo), produce en el organismo tuberculoso, una* reacción local y general, que se explica por lo que conocemos del fenómeno de la anafilaxia. En el individuo sano no se produce reacción alguna. La tuberculina puede ser aplicada a la piel de distintas ma- neras, por la inyección del dermis (Rómer), por la aplicación de unas gotas de solución de la tuberculina antigua al 25% so- bre una escarificación cutánea (Von Pirket) ; en este caso debe hacerse otra escarificación, que servirá de testigo y mediante la fricción durante un minuto de una pomada compuesta a partes iguales de tuberculina y lanolina. 102 LECCION XVI. Bacilo de Hansen de la Lepra. El germen productor de lepra, fue descubierto en 1873 pel- el bacteriólogo noruego Hansen, en el producto del raspado de los tubérculos leprosos. En estas lesiones se lé encuentra abun- dantemente, la mayor parte de las veces. Sin embargo otras, no sucede así y hay qne buscar el bacilo en otros lugares. El lugar en que casi siempre se encuentra el bacilo, es en las mu- cosidades nasales del enfermo. En todas las formas de esta en: fermedad, se encuentra siempre una pequeña úlcera en la par- te anterior de uno de los cornetes, que parece ser el chancro ini- cial de la enfermedad. Las principales formas clínicas de la le- pra son la tuberculosa y la anestésica o nerviosa, en la primera es en la que se encuentran abundantes los bacilos en las lesiones. ASPECTO MICROSCOPICO: Es un bacilo inmóvil, de 5 a 6 miera de largo por una de espesar, más fino que el bacilo de la tuberculosis, con el cual guarda grandes analogías. Sus extremidades son redondeadas. Presenta en su espesor, vacuo- 103 Técnica Bacteriológica las análogas a las que presenta el bacilo de Koch. TINCION: Se tiñe más fácilmente que el bacilo de Koc-h, por los colores básicos de la anilina y sin embargo resiste más a la decoloración, esto puede algunas veces servir para su diife- reneiación. Pertenece como ya sabemos al grupo de los bacilos ácido-alcohol-resistentes, por lo tanto usaremos el mismo méto- do de doble coloración cuya técnica ustedes conocen perfecta- mente. En estas preparaciones no aparece como los bacilos tu- berculosos, es decir, dispersos, sino que tienen tendencia a agru- parse, como si estuviesen aglutinados. Muchas veces aparecen en el interior de grandes células (células leprosas). Es positivo al Gram. BIOLOGIA.-Es aerobio. No forma esporos. Su tempera- tura óptima es la de 37° C. Solo es patógeno para el hombre. Las distintas inoculaciones que se han hecho a los animales, nunca han reproducido la enfermedad. Estas inoculaciones han tenido que hacerse con bacilos contenidos en los lepromas, pues todos los cultivos que de él se han intentado, han sido de resultados muy dudosos. En la mayoría no han germinado, en otros, han germinado otros extraños a él. E. Weill dice haber obtenido cul- tivos puros con agar adicionado de suero pleurítico y sobre agar- huevo. Es curioso el hecho de que los enfermos de lepra, reaccio- nan a la tuberculina, de la misma manera que los tuberculosos. No existe por ahora un método serológico específico, para el diagnóstico de la lepra. 104 LECCION XVII. Gonococo de Neisser. El gonococo fué descubierto por Neiser en el año de 1879, en el pus de los blenorrágicos. Se han obtenido cultivos puros de él, cuya inoculación en la uretra, reproducen la enfermedad. También se encuentra en las conjuntivitis blenorrágicas, espe- cialmente en las de los recién-nacidos, en las salpingitis, habien- do llegado a producir hasta peritonitis. Es solo en los primeros días de la uretritis que se encuentra aislado, porque a los tres o cuatro días, otras bacterias se asocian a él. ASPECTO MICROSCOPICO: Es un diplococo que tiene forma arriñonada de granos de café, dispuestos de manera que se miran por sus caras cóncavas. TINCION: Se colorea muy bien por el azul de Loeffler, en cuyas preparaciones vemos los gonococos, situados dentro de las grandes células de pus, es decir son intracelulares. Algunos de ellos pueden encontrarse fuera de estas células. Esto no tiene 105 Técnica Bacteriológica un gran valor diagnóstico y siempre acompañado de esta colo- ración debemos hacer un Gram. Coloreado por este método, es negativo. Este carácter si tiene un valor diagnóstico positivo, pues casi todos los otros micrococos son Gram-positivos, a excep- ción del meningococos de Weiselbaum, pero con éste, muy po- cas veces hay que hacer el diagnóstico diferencial. BIOLOGIA: El gonococo es aerobio. Su temperatura ópti- ma es de 35 a 37° C. A 15° C. muere en dos días. En la estufa pueden durar hasta un mes los cultivos. Se desarrolla con mucha dificultad en los medios de culti- vo. En caldo, gelatina y agar-agar o se desarrolla muy mal o no lo hace la mayor parte de las veces. Para crecer necesita me- dios que contengan gran cantidad de albúmina, de preferencia, cualquier albúmina humana. Estos medios que se preparan pa- ra su cultivo, son casi siempre agar- sangre, agar-ascitis, caldo suero, etc. No ha podido reproducirse la enfermedad en ningún animal. No confiere inmunidad. El tratamiento de las gonococcias por medio de las vacunas obtenidas con gérmenes muertos es muy eficaz. 106 INDICE LECCION 1 5 Medios de cultivo. Requisitos de un buen medio de cultivo. División de los medios de cultivo. . . * Medios líquidos. Medios sólidos , Caldo simple, Preparación del caldo simple. Neutralización del caldo simple. Clarificación. Esterilización. , Distintos métodos de esterilización por el calor. Pasteurización. Tyndalización. Variedades de caldo. LECCION II 19 Suero Manera de obtenerlos. Suero de Loeffler. Esterilización del suero. Aparato de Koch. LECCION III 25 Leche. . Propiedades. Medios de obtenerla y manipulación para usarla. . . * Sangre. . Orina. . • Huevo. . , Infusiones vegetales. Patata. LECCION IV 31 Agar-agar y gelatina Preparación. Filtración. ., Ventajas del agar-agar sobre la gelatina y vice-versa. LECCION V 35 Diversos métodos de siembras de bacterias. Siembra por estrías. Siembra por hisopo Siembra por punción. Siembra por agua de condensación. LECCION VI. 4 • • « • • 43 Cultivos de anaerobios. Método de extracción del aire. Método de liborius. ; > Método de la exclusión del aire. Método de la absorción del oxígeno. Método de la asociación microbiana. Método de la sustitución del aire por un gas inerte. Método de FraenM. DICCION VII 53 Métodos de aislamiento de bacterias. Método de alta dilución. Método de aislamiento en medios sólidos. Método de aislamiento por temperatura óptima Método de aislamiento por inoculación. Método de aislamiento en cultivos especiales LECCION VIII 61 Conteo de bacterias. LECCION IX 65 El microscopio y sus accesorios. Condiciones de un buen objetivo Manejo del microscopio. Colocación del objeto. Objetivos de inmersión. Revólver. Oculares. . • ' J Iluminación. t . • Condensador Abbé. A Diafragma iris. Manera de enfocar. Reglas a seguir en nuestro laboratorio. Cuidados con el microscopio. LECCION X 75 Examen microscópico de bacterias vivas Gota colgante Técnica. . LECCION XI. ' 79 Examen microscópico de bacterias coloreadas. Técnica general. Coloración simple por Carbol-Fuchsir.a. Coloración simple por azul de Loeffler. LECCION XII. 84 Métodos especiales de coloración. Coloración de bacilos ácido-resistentes. Coloración de esporos. Método de Gram. LECCION XIII 91 Bacilo del muermo. Origen. . Aspecto microscópico Tinción. . Biología. . Cultivo. . Diagnóstico. LECCION XIV 95 Bacilo de la difteria. Aspecto microscópico. Tinción. . Biología. . Diagnóstico. LECCION XV 99 Bacilo de la tuberculosis. Aspecto microscópico. Tinción. . Biología. . Cultivo. . Diagnóstico. LECCION XVI 103 Bacilo de la lepra. Aspecto microscópico. Tinción. Biología. * Cultivo. Diagnóstico. LECCION XVII 105 Gonococo de Neisser. Aspecto microscópico. Tinción. . Biología. .